Estudio de la expresión de una fosfolipasa termoestable recombinante en la levadura Kluyveromyces lactis

BRUNO SCHULZE; LAURA E. NAVAS; GRACIELA B. BENINTENDE; JORGE ARCAS; MARCELO F. BERRETTA

Mar del plata

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2018

Asociación Argentina de Microbiología

Las fosfolipasas tienen diversas aplicaciones en la industria alimentaria, como en el proceso de refinado de aceites vegetales, en la elaboración de productos lácteos, de panificación y emulsionantes. En trabajos previos caracterizamos una fosfolipasa bacteriana termoestable (PLP2.9), proveniente del aislamiento nativo Thermus sp. 2.9. La enzima recombinante producida en E. coli presenta actividad fosfolipasa A y aciltransferasa, a una temperatura óptima de 70 °C.En este trabajo se clonó y expresó el gen plp2.9 en la cepa de levadura Kluyveromyces lactis GG799, con vistas a expresar la enzima secretada en el medio de cultivo. Este organismo cuenta con un historial GRAS (generally regarded as safe) para la producción heteróloga de enzimas para la industria alimentaria. El gen plp2.9 fusionado a la secuencia de la señal de secreción del gen α-mf (mating factor) se integró en el locus LAC4, bajo el promotor inducible del gen que codifica la β-galactosidasa. Para la recombinación con el genoma de la levadura se utilizó un cassette de integración conteniendo el gen codificante de una acetamidasa que le confiere la capacidad de crecer en presencia de acetamida como única fuente de N. Se obtuvo un clon recombinante, K. lactis-plp2.9, en el que se confirmó la integración del cassette de expresión por PCR. Para analizar la producción de PLP2.9 recombinante, primeramente se determinaron las condiciones óptimas de crecimiento para la cepa parental. Posteriormente, se cuantificó actividad fosfolipasa a 65 °C, en cultivos de K. lactis-plp2.9, a distintos tiempos, utilizando glucosa, galactosa y lactosa, como fuentes de carbono y energía alternativas. A las 72 hs de cultivo, tanto con galactosa como con lactosa, se obtuvo actividad fosfolipasa levemente mayor en el sobrenadante de cultivo de K. lactis-plp2.9, en comparación con la cepa control. En cambio, la mayor actividad relativa producida por K. lactis-plp2.9 se obtuvo en la fracción celular, en todas las condiciones de cultivo ensayadas. Después de lisar mecánicamente las células, la actividad fosfolipasa se distribuyó similarmente entre la fracción soluble y la fracción precipitable del homogenato. Se determinó la termoestabilidad de la enzima asociada a células, obteniéndose una actividad relativa mayor a 100% después de incubar dicha fracción a 85ºC, hasta 50 horas. Este resultado contrasta con la relativamente baja termoestabilidad observada a la misma temperatura para la enzima pura producida en E. coli.