Análisis y expresión de enzimas termofílicas multicobre oxidasas de la bacteria Geobacillus sp. T6

FERNANDO MARTINEZ; LAURA E. NAVAS; GRACIELA B. BENINTENDE; ELEONORA CAMPOS; MARCELO F. BERRETTA

Bahía Blanca

Congreso; XI Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO; 2017

REDBIO Acociación Civil

Las multicobre oxidasas (MCO) son una familia de enzimas que catalizan la oxidación de un amplio rango de compuestos aromáticos y resultan de gran interés biotecnológico para aplicaciones en las industrias papelera, textil, alimentaria y cosmética. Contienen generalmente 4 átomos de cobre en su centro catalítico y se han reportado de uno, dos, tres y seis dominios. A pesar de su diferencia estructural, los aminoácidos de unión al cobre se encuentran altamente conservados entre los distintos tipos. Específicamente, las lacasas tienen actividad fenol oxidasa y actualmente se está investigando su uso en la degradación de lignina para la producción de bioetanol a partir de biomasa vegetal. Estas enzimas han sido halladas en plantas, hongos, insectos y bacterias. La información disponible sobre lacasas bacterianas es escasa, sobre todo de las provenientes de bacterias termófilas. En trabajos previos de nuestro grupo se obtuvo la secuencia del genoma completo de un aislamiento bacteriano termófilo de crecimiento óptimo a 65 °C, denominado Geobacillus sp. T6, a partir de cuya anotación se revelaron genes codificantes de enzimas con potenciales aplicaciones biotecnológicas.En este trabajo se han seleccionado tres genes que codifican proteínas MCO, las cuales se denominaron LAC09, LAC58 y LAC63. Los pesos moleculares predichos para cada una se determinaron en 29,8 kDa, 38,1 kDa y 58,6 kDa, respectivamente.Se realizaron alineamientos múltiples entre dichas secuencias de aminoácidos con otras MCO bacterianas y se realizó un árbol filogenético, resultando que las tres lacasas se ubicaron en distintos grupos. LAC09, LAC58 y LAC63 agrupan con enzimas MCO de uno, dos y tres dominios, respectivamente. En las tres secuencias se encuentran conservados los aminoácidos que estarían involucrados en la unión a cobre. Dadas las diferencias tanto a nivel de secuencia como de dominios, resultó de interés realizar la producción recombinante de las tres enzimas.El clonado de los tres genes se realizó en el vector para expresión en E. coli, pJexpress404, inducible por IPTG. Se evaluaron distintas condiciones de expresión. En la mayoría de los casos se obtuvo sobreexpresión de las proteínas del peso molecular esperado en forma soluble. La actividad de las enzimas se determinó frente al sustrato ABTS (2,2´-azino-di- [3-etilbenzotiazolina sulfonato]) a 60 °C y pH 5.LAC09 y LAC58 resultaron activas únicamente expresándolas en presencia de cobre en el medio y manteniendo el cultivo en microaerobiosis después de la inducción con IPTG. Dicha condición de cultivo favorece la incorporación del cofactor dentro de la célula, lo que contribuiría al plegamiento correcto de las enzimas. LAC63 resultó activa tanto en condiciones de aerobiosis como de microaerobiosis, incrementando su actividad con el agregado de cobre durante la expresión.Como conclusión, se obtuvieron tres enzimas recombinantes termofílicas con actividad multicobre oxidasa (EC 1.10.3.2) a alta temperatura. Se optimizaron las condiciones de expresión para la obtención de sus formas activas, siendo dos de ellas estrictamente dependientes del agregado de cobre. La disponibilidad de un sistema funcional para la expresión de enzimas MCO bacterianas termófilas permitirá avanzar en la caracterización bioquímica de las mismas e identificar candidatos promisorios para su evaluación en la degradación de biomasa vegetal.