Análisis de pFR260, un nuevo megaplásmido presente en el genoma de Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4

LAURA E. NAVAS; ARIEL F. AMADÍO; ELIO M. ORTIZ; DIEGO H. SAUKA; GRACIELA B. BENINTENDE; RUBÉN O. ZANDOMENI; MARCELO F. BERRETTA

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva que produce cristales parasporales (proteínas Cry) con actividad insecticida durante la fase de esporulación. También puede producir durante su etapa de crecimiento vegetativo proteínas insecticidas solubles llamadas Vip.Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4 es un aislamiento proveniente de suelo de la provincia de Misiones, de interés para el aprovechamiento de nuevas proteínas con potencial actividad insecticida. En estudios previos de nuestro grupo de trabajo se identificaron y caracterizaron tres genes codificantes de proteínas de tipo Cry.En este trabajo se ha avanzado en la secuenciación del genoma completo mediante la plataforma Illumina MiSeq obteniendo lecturas pareadas de 150 pb a partir de una biblioteca genómica de 8 kpb. Para la búsqueda de nuevos plásmidos, se realizó un ensamblado de novo filtrando aquellos scaffolds obtenidos con similitud a plásmidos de la especie. Cuatro de estos scaffolds combinados con las secuencias de los genes insecticidas obtenidas previamente se ensamblaron en un único scaffold cuyos extremos se superponen, sugiriendo circularidad correspondiente a un elemento extracromosomal. Se cerraron 16 gaps de secuencia mediante amplificación por PCR y posterior secuenciación y ensamblado de las secuencias obtenidas al scaffold, demostrando la presencia de un megaplásmido de 260.595 pb, nombrado pFR260. La anotación de este megaplásmido se realizó utilizando una combinación de las herramientas PROKKA y RAST, resultando en 217 CDSs luego de un curado manual.La secuencia de pFR260 no presenta similitud global (a lo largo de toda la secuencia) con otro plásmido secuenciado hasta el momento. Al comparar la secuencia completa de pFR260 con secuencias depositadas en las bases de datos, se observan similitudes parciales con plásmidos del grupo B. cereus.El plásmido se caracteriza por la presencia de una región con características de una isla de patogenicidad. Posee todos los genes insecticidas del aislamiento: tres genes cry8, dos vip1 y dos vip2 diferentes entre sí, y un gen codificante de una proteína que contiene un dominio de una toxina Cry atípica; además de otros factores de virulencia inespecíficos. Adicionalmente, se encontró una secuencia corta codificante de un fragmento de 182 aminoácidos que posee similitud con la región central de una toxina Cry8. Las proteínas Cry8 se han reportado con toxicidad contra coleópteros y lepidópteros, y las proteínas Vip1/Vip2 contra coleópteros y hemípteros. Estos tipos de proteínas no se encontraban codificadas en las islas de patogenicidad descriptas hasta el momento en B. thuringiensis.Por todo esto, se define a pFR260 como un novedoso megaplásmido de B. thuringiensis en el cual se describe por primera vez una isla de patogenicidad que contiene genes asociados primariamente a toxicidad contra coleópteros.