Clonado y expresión de dos nuevos genes cry8 provenientes del aislamiento de Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4

LAURA E. NAVAS; ARIEL F. AMADÍO; ELIO M. ORTIZ; IRMA, FUXAN; MARCELO F. BERRETTA; DIEGO H. SAUKA; GRACIELA B. BENINTENDE; RUBÉN O. ZANDOMENI

Buenos Aires

Congreso; II CONGRESO DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y AMBIENTAL; 2013

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria esporógena con actividad insecticida atribuida principalmente a sus proteínas Cry, formadoras de cristales tóxicos para varias especies de insectos plaga de la agricultura. Algunas cepas de Bt pueden contener un solo gen cry, mientras que otras presentan perfiles génicos más complejos. Las proteínas Cry se clasifican en clases y subclases en base a la identidad de su secuencia aminoacídica. La búsqueda de nuevos genes codificantes de proteínas Cry es un área de activa investigación, hecho reflejado en el constante incremento de genes cry en las bases de datos. Bt INTA Fr7-4 es un aislamiento obtenido a partir de una muestra de suelo de la provincia de Misiones. En el presente trabajo se llevó a cabo la caracterización, clonado y expresión de dos nuevos genes cry8 provenientes de dicho aislamiento. Utilizando cebadores consenso de genes cry8, se amplificó por PCR el marco de lectura completo de un gen denominado cry8-01. Considerando que genes cry de otras clases se agrupan en regiones del genoma o islas de patogenicidad, se delineó una estrategia basada en PCR donde se evaluaron distintas combinaciones de cebadores internos diseñados sobre genes cry8, con los que se detectó la presencia de otro gen llamado cry8-02, 5,6 Kpb corriente abajo del gen cry8-01. Las secuencias deducidas de aminoácidos de los genes cry8-01 y cry8-02 comparten la máxima identidad con Cry8Ka2 (89%) y Cry8Ba1 (74%), respectivamente. Se secuenció la región intergénica y tomando como base esta secuencia se diseñaron dos pares de cebadores con los que se logró amplificar por separado cada gen cry8 con su propio promotor. Dichos productos se clonaron en el vector pHT3101 el cual contiene un origen de replicación funcional en Bt. Con los clones obtenidos se transformó la cepa de Bt serovar israelensis 4Q7 (acristalífera). El análisis de la expresión por microscopía óptica permitió observar la presencia de cristales en ambos transformantes, de menor tamaño en comparación a los cristales de la cepa silvestre INTA Fr7-4. El análisis por SDS-PAGE demostró la producción de las proteínas Cry8-01 y Cry8-02, ambas de 130 kDa, coincidente con el peso molecular esperado para ambas y similar al de otras proteínas Cry8 conocidas. El nivel de expresión de cada cry8 en la cepa transformante es visiblemente más bajo que el de la expresión indiferenciable de ambos en la cepa silvestre. Este es el primer trabajo que reporta la presencia de dos genes cry8 cercanos en el genoma. Estos nuevos genes insecticidas podrían reportar nuevas actividades tóxicas contra insectos, abriendo la posibilidad al desarrollo de bioplaguicidas.