Estudio de las propiedades circadianas y fotosensibles de una nueva línea de células ganglionares de la retina de rata (RGC-5)

NIETO PAULA S; VALDEZ DIEGO J; GUIDO MARIO E

Buenos Aires- Argentina

Congreso; Asociación Argentina de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO); 2007

Asociación Argentina para la Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO)

Objetivos: Nuestro laboratorio demostró que las células ganglionares de retina (RGCs) de pollo in vivo son osciladores circadianos autónomos y que cultivos primarios de RGCs de embriones de pollo pueden actuar como células fotosensibles no clásicas  (Garbarino et al., 2004; Contín et al., 2006). El objetivo del presente trabajo fue extender dichos estudios a una línea celular derivada de RGCs de ratas, denominada RGC-5. Esta línea expresa marcadores típicos de RGCs como thy-1, brn-3c, neuritina y NMDAr (Krishnamoorthy et al., 2001). Se estudió en las  células RGC-5  la expresión de proteínas reloj (Per1, Per2, Cry, Bmal-1 ), la expresión de la enzima AA-NAT y su actividad enzimática, la inducción de la proteína c- Fos mediante pulsos de luz blanca y cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ en respuesta a diferentes estímulos lumínicos y no lumínicos. Por otro lado, las RGC-5 tendrían la capacidad de diferenciar morfológicamente hacia un fenotipo neuronal en respuesta a la Staurosporina (Ssp) (Frassetto et al., 2006). En el presente estudio se analizó también el efecto de la Ssp en  la diferenciación de las RGC-5. Materiales y métodos: Los niveles de proteínas reloj  y de c-Fos fueron determinados mediante Western Blot. La expresión de la enzima AA-NAT fue determinada mediante PCR y su actividad enzimática fue medida de acuerdo a (Chapney et al., 1984) . Los niveles de Ca2+ intracelular fueron determinados mediante el uso del fluoróforo Fura-2. El efecto de la Ssp fue determinado mediante tinción de núcleos con DAPI y citometría de flujo con IP.  Resultados: Las RGC-5 expresan las proteínas Per1, Per2 y Cry con un máximo entre las 8-12 hs mientras que los niveles de Bmal-1 se mantienen elevados durante las primeras horas (0-2 hs) post sincronización. Además, las RGC-5 expresan el ARNm de la enzima AA-NAT; sin embargo no hubo niveles detectables de actividad enzimática. Por otra parte, un pulso de  luz blanca fría de intensidad de 1000 lux durante 30 min indujo la expresión de la proteína c-Fos. Complementariamente, las respuestas de las RGC-5 a estímulos lumínicos se están estudiando mediante el seguimiento in vivo de los cambios intracelulares de Ca2+. El tratamiento de las RGC-5 con  Ssp  diferencia morfológicamente a las células de una manera dosis-tiempo dependiente, sin embargo esta diferenciación es nociva, induciendo niveles de apoptosis elevados a las 48 -72 hs post-diferenciación.