Actividad de Fosfatasa Alcalina Placentaria en filmes de Langmuir-Blodget

CLOP, E. M.; PERILLO, M.A.

Carlos Paz. Argentina.

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

La fosfatasa alcalina placentaria (FAP) es una proteína anclada a la hemicapa exterior de la membrana celular por medio de un grupo glicofostatidil inositol (GPI). La porción GPI se ubicaría perpendicularmente al plano de la membrana y el eje mayor de la parte proteica, paralelo a la interfase (1), a una distancia menor a 1,0-1,4 nm de la superficie (2). Este contacto permitiría la transmisión de información sobre los cambios estructurales entre la proteína y la interfase afectando su actividad catalítica (ver 3). Asumiendo que esta organización de la FAP en membranas modelo refleja la que existe en biomembranas,  se espera que la parte proteica de la FAP, en condiciones naturales, esté inmersa en el glicocaliz (GC) celular cuyo espesor sería próximo a 7-15 nm (4). Esta región participa en el reconocimiento de señales y en interacciones intercelulares. El GC podría ser considerado un ambiente molecularmente superpoblado donde tanto la conformación como la actividad de proteínas podría ser afectada debido a fenómenos de volumen excluido y a efectos sobre la estructuración del agua y la difusión de solutos. En SAB2004 (5) presentamos resultados sobre reología de filmes de Langmuir conteniendo FAP.      El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del empaquetamiento molecular, en condiciones de curvatura plana constante, sobre la cinética de la hidrólisis de o-nitrofenilfosfato (ONPP) catalizada por FAP presente en filmes tipo Langmuir-Blodgett (LB) (1 capa: 1c o dos capas: 2c) empaquetados a dos presiones laterales iniciales (pi), 15 y 35 mN/m. Los LB se prepararon a partir de monocapas de membranas placentarias purificadas (LBMP) o FAP pura incorporada a una monocapa de dpPC desde la subfase acuosa (LBFAP). Como controles se usaron suspensiones de membranas placentarias (MP) y dispersiones de FAP purificada en medio acuoso (FAPAq). Todas las mediciones se realizaron en presencia de PEG 6000 a concentraciones entre 0 y 30 %PV en el sistema de incubación, para simular condiciones de superpoblación molecular (6). Fue necesario desarrollar un método para realizar transferencias seriadas de filmes LB a soportes hidrofóbicos, a los fines de contar con gran cantidad de muestras para los estudios cinéticos.         A diferencia de lo que observamos para otras proteínas incorporadas a la estructura de la membranas, donde el aumento en la p indujo un cambio hacia una cinética sigmoidea, la cinética de hidrólisis de ONPP catalizada por FAP fue hiperbólica en todas las condiciones ensayadas. La FAPAq mostró la mayor actividad específica (13,28 mmol/min /mg), comparativamente con MP, LBMP y LBFAP, (VmFAPAq>VmLBMP >VmMP >VmLBFAP). Los valores de KM para FAPAq y MP fueron @3 mM (2.73 ± 0.16 y 3.12 ± 0.58 respectivamente) y los de  LBFAP y LBMP fueron @4 mM (3.9 ± 0.32 y 3.86 ± 1.2 respectivamente). La actividad específica de LBFAP fue mayor en las muestras preparadas a  pi =15mN/m respecto a 35 mN/m (0.19 ± 0.05 y 0.0609 ± 0.0021 mmol/min/mg) mientras que la afinidad E-S fue similar. El efecto de PEG se evaluó sobre FAPAq y  FAPLB preparadas a  pi 15 y 35mN/m. Para FAPAq Vmax fue PEG0%=PER15%<PEG30% >PEG45%. Para KM se observó un mínimo con  PEG15% (0.3744 ± 0.1499mM) y un máximo con PEG30% (10.75 ± 2.34mM) con un valor de 2.48 ±1.39 para PEG45%. En presencia de PEG, en LBFAP a pi =15 mN/m se observó una marcada disminución en la actividad (0.078 ± 0.0046 mmol/min/mg)  y un aumento en la afinidad (0.996 ± 0.194 mM) en función de la concentración de PEG. Para LBFAP a pi =35 mN/m, no se observaron variaciones en la Vmáx con el agregado de PEG15% y PEG30%,  mientras que se observó una disminución en la KM en función de la concentración de PEG.         VmMP<VmLBMP se debe a la pérdida de proteínas no FAP durante la formación del filme Langmuir y VmFAP15>VmFAP35, a la mayor  incorporación de FAP desde la subfase para pi =15 mN/m. FAP es más sensible a PEG cuando está en filmes LB, particularmente a baja pi.1.      Ronzon et al., (2002) Biochim.Biophys.Acta,1560:1-13.2.      Lehto & Sharom (2002),Biochemistry 41: 8368-76.3.      Caseli et al., 2005 Langmuir. 21:4090-5.4.       Horiuchi K., Naito I., Nakano K., Nakatani S., Nishida K., Taguchi T., Ohtsuka A.,Arch. Hystol. Cytol. et al, 2005.5.       Clop E. y Perillo (2004) Medicina, 64 (Supp.II), pg 3246.       Collin et al.,(2004), Medicina, 64 (Supl.II), pg 91