PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE PEROXIDASA DE RABANITO (Raphanus sativus L) MEDIANTE PRECIPITACIÓN CON POLIACRILATO

RAUSCH, CAREN; NADIA WOITOVICH VALETTI; GUILLERMO PICÓ

Zavalla

Congreso; XV Congreso y XXXIII Reunión Anual de la sociedad de biología de Rosario- Año 2013; 2013

Sociedad de Biología de Rosario

Las peroxidasas (EC 1.11.1.x; POD) son hemo-proteínas que catalizan la reducción de H2O2 acoplada a la oxidación de una amplia variedad de sustratos. Son enzimas ubicuas en la naturaleza y se encuentran implicadas en un amplio rango de funciones. Se encuentran agrupadas en dos superfamilias de POD: de plantas y animales, y han sido identificadas en todas las plantas superiores conocidas. Dentro de las POD presentes en plantas se identificaron un amplio rango de isoformas con pI, especificidades y localización variables. Estas enzimas son de particular interés debido al amplio rango de reacciones que catalizan y su elevada sensibilidad. Dentro de los principales usos de las mismas se pueden citar: inmunoensayos, síntesis de compuestos orgánicos, remediación de aguas contaminadas con peróxidos, entre otras. Las POD han sido purificadas de un amplio rango de organismos pero los métodos empleados para su purificación son tediosos y costosos lo que incrementa el valor final de las mismas. La precipitación con polielectrolitos (PE) es una nueva alternativa para la purificación y concentración de proteínas. La metodología se basa en la interacción entre proteínas y PE con carga opuesta para dar lugar a complejos insolubles que pueden ser separados del resto de los componentes mediante centrifugación. La purificación utilizando PE es simple, tiene bajos costos y es escalable, lo que posibilita su aplicación en la industria. En este caso, se estudio la precipitación de POD de rabanito (Raphanus sativus L) utilizando un polímero sintético cargado negativamente: el poliacrilato (PAA). Durante el trabajo experimental se analizaron diferentes aspectos del proceso de precipitación de POD utilizando como material de partida un extracto de rabanito: pH de precipitación, estequiometria y cinética de la interacción y efecto de la temperatura sobre la eficiencia de la precipitación. Se encontró que el pH adecuado para la precipitación es de 4,00 y que a este pH se requiere una muy baja concentración de PAA (7.0. 10-4 %P/P) para alcanzar el máximo rendimiento de la precipitación. La cinética de la precipitación es rápida, llegando a completarse en menos de un minuto. No se encontró un marcado efecto de la temperatura sobre la eficiencia de la precipitación en el rango de temperaturas ensayadas (0, 20 y 40 ºC) lo que indica que el proceso puede ser llevado a cabo sin un estricto control de la temperatura, un parámetro que es costoso regular a escala industrial. Se logró un factor de purificación de 1,8 con un rendimiento del 55%. Con el objetivo de concentrar las muestras, se estudió la disminución del volumen de re-disolución del precipitado y se encontró que es posible reducir 10 veces el volumen inicial de la muestra manteniendo constante la cantidad de POD recuperada. Finalmente, se determinó mediante el empleo de sistemas bifásicos acuosos polietilenglicol-dextrano a diferentes pH y con diferentes fuerzas iónicas, el punto isoeléctrico de esta POD en particular. Se encontró que en el extracto de trabajo se encuentran diferentes isoenzimas de POD cuyo pI varía entre 4,62 y 5,51.