Biosensor para determinación de oxalato en orina con oxalato oxidasa inmovilizada en matrices mucina/carbopol

R. CAPRA, T. BENAVIDEZ, L. QUINZANI, M. STRUMIA, A. BARUZZI

Merlo, San Luis, Argentina.

Congreso; III CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA ANALÍTICA; 2005

Asociación Argentina de Químicos Analíticos

El oxalato es un producto del metabolismo proteico el cual es eliminado por el riñón; es tóxico a altas concentraciones debido a que forma complejos insolubles con cationes divalentes principalmente con calcio. Es el principal componente de la mayoria de los cálculos renales, por ello la determinación de oxalato en orina es de gran utilidad para el manejo de la urolitiasis. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un biosensor enzimático amperométrico para medición de oxalato, con rango analítico amplio y estabilidad mejorada comparado con sensores que utilizan albúmina en la matriz que contiene la enzima. La medición de oxalato se basa en descomposición de este por parte de la oxalato oxidasa, para dar CO2 y H2O2 de acuerdo con la siguiente reacción: O2 + (COOH)2 -----------»2CO2 + H2O2 La cantidad de oxalato se determina indirectamente a través de la medición amperométrica de H2O2. La oxalato oxidasa fue inmovilizada en una matriz mucina/carbopol entrecruzada con glutaraldehído, contenidas entre dos membranas poliméricas. Mucina y oxalato oxidasa fueon obtenidas de Sigma Ltd., Carbopol 940 de Noveon, Glutaraldehído de Mallinckrodt Baker, USA. Las membranas poliméricas utilizadas para contener la matríz fueron policarbonato de 0.05um de diámetro de poro y sulfonato de polieter sulfona-polieter sulfato (SPEES-PES). Las muestras de orina fueron provistas por el Hospital Privado de Córdoba. Para la medición electroquímica de H2O2 se adaptó una celda para detección de O2 (Rank Brothers, Botisham, Cambridgeshire, UK), polarizando el electrodo de trabajo a + 0.65 V ( vs Ag/AgCl). Como fuente de polarización se utilizó un analizador electroquímico Autolab (Ecochemie). Para la preparación de los electrodos se mezclaron 6 microlitros de solución conteniendo la enzima (2.69 U/mL) en albúmina o mucina y carbopol ( 70/30 relaci{on en pesos) con 3 microlitros de glutaraldehído ( 5% v/v), se aplicó inmediatamente esta mezcla sobre una membrana de SPEES-PES y sobre esta se colocó una membrana de policarbonato. El sandwich resultante se colocó sobre el electrodo de trabajo de Pt. Las curvas de calibración del electrodo se obtuvieron por adición de 40 micro litros de solución de oxalato de sodio a 4 mL de buffer sucesivamente. Para análisis de selectividad se agregaron interferentes junto con las soluciones estándar y se registraron los cambios en la respuesta electroquímica. La estabilidad fue evaluada realizando curvas de calibración en días sucesivos. Se observó intervalo lineal de 2-400 microM después d una dilución 1/10 de las muestras de orina (correspondiente a 20-4000 microM) lo cual lo hace apropiado para uso clínico. Se encontró una alta correlación con el método espectrofotométrico de uso más frecuente (R2 = 0.98 y=0.89x, n=25). Los resultados demostraron que el carbopol estabiliza la matriz enzimática yquela mucina es la responsable del control difusional, lo cual significó una mejora en el intervalo lineal con respecto al sensor que utiliza albúmina como agente inmovilizante en la matriz.