Cuantificación de la expresión transgenica mediada por vectores Adenovirales en el núcleo rojo de la rata

MOREL GR, ZUCCOLILLI GO, PORTIANSKY EL, GOYA RG

Villa Giardino, Cordoba

Taller; VII Taller Argentino de Neurociencias; 2005

Internacional Brain Researche Organization (IBRO)

Con el objetivo general de poner a punto la metodología morfométrica necesaria para cuantificar la expresión de transgenes terapéuticos en modelos animales de neurodegeneración senil, se determinó en el núcleo rojo (NR) de la rata la expresión transgénica de dos vectores adenovirales a saber, 1) Ad.nls.b-gal, portador del gen de la b-galactosidasa de E. coli; 2) RAd(GFP-TK)fus, portador de un gen para una proteína de fusión entre la green fluorescent protein (EGFP) y la timidina kinasa herpética (TK). Estudios preliminares habían demostrado que la expresión transgénica mediada por vectores adenovirales es particularmente homogenea en el NR, razón por la cual se eligió esta estructura para el presente trabajo. Debe señalarse además, que un problema encontrado frecuentemente durante la medición de la expresión de transgenes inyectados estereotáxicamente en el cerebro de rata es la presencia de una alta densidad de expresión transgénica en el trayecto de la aguja en relación a la expresión que se observa en la región de inyección propiamente dicha. Esta inhomogeneidad dificulta la cuantificación precisa de la distribución total de la expresión. Para evitar este problema se decidió efectuar las inyecciones virales en coordenadas vecinas al NR (AP=4,7; ML=1,2; DV=7mm; Paxinos, 1998). Ratas macho Sprague-Dawley de 3-4 meses de edad se perfundieron por vía intracardíaca con PBS-4% paraformaldehído. Se obtuvieron secciones coronales de 40µm que se incubaron con el reactivo X-gal para revelar la actividad de la b-gal. Las imágenes del NR se capturaron con una cámara digital DP70 anexada a un microscopio Olympus BX51 para microscopía de luz y fluorescencia, con una magnificación de 20X. La imágenes se analizaron mediante el software Image Pro Plus v5.1 (Media Cybernetics) con una profundidad de pixel de 24 bits formato RGB y TIFF. Los límites del NR fueron delineados y dentro de este área solo se contaron las células reactivas para X-gal o fluorescentes, según correspondiese, células >100 :m2 que con una expresión claramente visible. Se estudiaron y compararon los perfiles de expresión in vivo de b-gal y EGFP en estudios de corto plazo, 48 hs post inyección (PI), así como estudios de expresión de mediano plazo (2, 42 y 52 PI) del gen de b-gal. Se observó que la expresión de la b-gal se mantiene con los mismos niveles en el NR a los 2, 42 y 52 PI. La expresión de la EGFP (2 días PI) mostró el mismo nivel de expresión que la b-gal. Se concluye que ambos transgenes muestran un patrón similar de expresión en el NR a corto plazo. En términos cuantitativos, la expresión adenoviral de b-gal se mantiene a niveles significativos al menos durante 52 PI, lo cual indica que nuestros vectores adenovirales son apropiados para implementar estrategias experimentales de mediano plazo en el NR.