Nueva proteína recombinante con potencial para el diagnóstico de histoplasmosis

TOSCANINI MA; GONZALEZ MAGLIO DH; IOVANNITTI C; NUSBLAT AD; CUESTAS ML

Congreso; VII Congreso Hospital Muñiz; 2019

Introducción: La histoplasmosis es una micosis sistémica endémica ampliamente distribuida en América causada por el hongo Histoplasma capsulatum. Los pacientes inmunocomprometidos pueden contraer la forma diseminada de la enfermedad (HD), la cual tiene mal pronóstico y requiere diagnóstico y tratamiento rápidos. Pocos antígenos (Ag) se utilizan para el inmunodiagnóstico de histoplasmosis: la histoplasmina (HMN), que contiene a los exoantígenos H, M y C, el galactomanano y un Ag polisacárido HPA (1). El uso de la HMN para la detección de anticuerpos (Acs) está limitado por su baja sensibilidad y especificidad, particularmente, en inmunocomprometidos, y además los métodos actuales para su producción requieren mucho tiempo y son problemáticos (2). De ahí la importancia de trabajar con antígenos recombinantes (Agr). Por otra parte, IMMY es la única empresa que comercializa un kit que cuenta con la aprobación de la FDA y que ha sido validado por el CDC para el diagnóstico directo de la histoplasmosis, mediante la detección de Ag de H. capsulatum. En este caso, el diseño es un ELISA de tipo sándwich donde usa Acs policlonales o monoclonales anti-levaduras muertas de H. capsulatum de cepas norteamericanas. Este kit no se encuentra disponible en muchos países del mundo donde esta micosis es endémica; en Argentina solo se encuentra disponible en pocos hospitales. Por otro lado, su costo comercial es elevado y utiliza Acs específicos contra cepas circulantes en regiones geográficas limitadas. Solo se encuentra validado para muestras de orina, lo que implica que para algunas formas clínicas, como es la meníngea no resulte adecuado. Por lo tanto, existe la necesidad de buscar nuevos candidatos antigénicos para el diagnóstico de histoplasmosis. Por ello, se propuso la proteína Hcp100 de H. capsulatum como un nuevo blanco para diagnóstico de histoplasmosis debido a su rol esencial en la adaptación y supervivencia del hongo dentro de los macrófagos durante la infección. Además, la expresión de Hcp100, puede proporcionarnos un Ag que sea independiente del aislamiento de H. capsulatum usado y pueda reemplazar al Ag nativo utilizado en los ensayos de inmunodifusión (ID) y/o ELISA que habitualmente se realizan en los laboratorios de micología. Asimismo, la producción de Acs dirigidos contra la Hcp100 permitiría detectar la presencia del hongo, en pacientes con HD o con otras formas graves de la enfermedad, donde el diagnóstico mediante búsqueda de Acs tiene baja sensibilidad y la búsqueda de Ags constituye la metodología apropiada. Objetivos: Expresar de forma recombinante Hcp100 y evaluar su uso como potencial candidato antigénico para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico más eficaces de histoplasmosis. Materiales y Métodos: El gen de Hcp100 se expresó en la levadura Pichia pastoris y se purificó mediante una columna de cromatografía de afinidad. Su presencia y pureza se evaluaron mediante SDS-PAGE y Western blot y su inmunorreactividad se analizó por ID con un suero de un paciente con HD y un suero humano normal (SHN). Asimismo, la Hcp100 recombinante purificada se utilizó para inocular ratones BALB/c y obtener Acs policlonales cuya especificidad fue evaluada por dotblot usando como Ags Hcp100, HMN, coccidioidina y paracoccidioidina. Finalmente, la utilidad de Hcp100 como Ag diagnóstico fue evaluada mediante dotblot analizando 6 orinas de pacientes con HD, 5 de ellos con HIV/sida y 2 orinas humanas normales (OHN). Por otro lado, mediante ELISA se analizó la presencia de Acs anti Hcp100 en muestras de suero de 15 pacientes con histoplasmosis. Cinco de ellos tenían la forma crónica, uno la forma diseminada y nueve tenían HIV/sida y la forma diseminada de histoplasmosis. El diagnóstico para todos los individuos fue confirmado por cultivo o histopatología. Se incluyeron muestras de suero de pacientes con paracoccidioidomicosis, coccidioidomicosis, criptococosis, tuberculosis y neumocistosis. Como controles negativos se utilizaron 20 SHN. Resultados: Hcp100 fue expresada de forma recombinante a escala del mg y purificada al 90%. Hcp100 demostró ser inmunorreactiva por ID contra un suero de un paciente con HD sin mostrar reacción con el SHN. Se obtuvieron Acs policlonales de ratón específicos anti-Hcp100 los cuales no mostraron reacciones cruzadas con coccidioidina y paracoccidioidina. En las seis orinas evaluadas fue posible detectar Hcp100 sin ser detectada en las OHN. La sensibilidad del ELISA de detección de Acs fue del 80% y la especificidad del 82%. Cabe destacar que 6 de los 9 pacientes con sida dieron positivo por ELISA, mientras que ninguno fue positivo por ID. Conclusiones: El nuevo Agr Hcp100 demostró tener un gran potencial para ser usado en el desarrollo de herramientas diagnósticas de histoplasmosis. Se requiere un mayor número de muestras clínicas para continuar con su validación.