VP2 expresada in planta promueve una respuesta inmune contra el Virus de la Bursitis Infecciosa

GOMEZ, E.; LUCERO, M.S.; CHIMENO ZOTH S.A.; CARBALLEDA, J.M.; BERINSTEIN, A.

CABA

Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011

Asociación Argentina de Microbiología

El virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) es el agente causal de una enfermedad aguda sumamente contagiosa que afecta a pollos jóvenes y causa importantes pérdidas económicas a la industria avícola mundial. IBDV es el miembro mejor caracterizado dentro de la familia Birnaviridae. Es un virus desnudo y posee genoma de ARN doble cadena bisegmentado. La proteína VP5 de IBDV es no estructural y se encuentra codificada en la region 3´ del segmento A del ARN viral. Su marco de lectura está parcialmente superpuesto con el de la poliproteína que origina a las proteínas VP2, VP3 y VP4. Es una proteína rica en cisteínas y se encuentra muy conservada entre distintas cepas de IBDV. La función de la proteína VP5 no ha sido descripta hasta el momento; además, existen datos contradictorios en cuanto a su capacidad para inducir o inhibir la apoptosis en células infectadas con el virus. Por otra parte, aunque fue demostrada su acumulación en la membrana plasmática en distintos tipos celulares, no se conoce la topología de la misma. VP5 posee un dominio hidrofóbico que fue propuesto como putativo dominio transmembrana. El objetivo del presente trabajo consistió en estudiar la localización subcelular de la proteína VP5 de IBDV mediante la técnica de protección de la fluorescencia frente a la proteasa (PFP). Brevemente, la misma consiste en fusionar, mediante clonado en vectores de expresión eucariota, la proteína fluorescente amarilla (YFP) y la proteína fluorescente cian (CFP) a los extremos N- y C-terminal de VP5, respectivamente y en construcciones independientes, bajo el promotor de citomegalovirus (CMV) para luego transfectar células QM-7 (fibroblastos de embrión de codorniz), susceptibles a la infección con IBDV. Si la proteína VP5 es una proteína transmembrana, un extremo de la misma se expondrá al espacio intracelular y el otro, al espacio extracelular. En cambio, si la proteína está asociada a la membrana plasmática, ningún extremo estará expuesto al espacio extracelular. La técnica consiste en la observación de las células transfectadas por microscopía confocal ante el tratamiento con proteinasa K. Si la proteína fluorescente se encuentra en el espacio extracelular, la proteasa accederá a ella y la degradará, apagando la fluorescencia. Si la proteína fluorescente se encuentra dentro de la célula, la proteasa no podrá acceder y la fluorescencia desaparecerá sólo cuando las células se pretraten con digitonina,, que induce poros en la membrana plasmática permitiendo el acceso de la proteasa al interiorcelular. Los resultados obtenidos muestran que la proteína VP5 se localiza en la membrana plasmática de las células QM-7, tanto cuando porta la fusión en C- como en N-terminal. Por otra parte, y debido a que en las células transfectadas con ambas construcciones, la fluorescencia permaneció protegida de la acción de la proteasa, la proteína VP5 estaría asociada a la membrana plasmática y no inserta dentro de la misma. Ensayos en curso permitirán caracterizar con mayor profundidad la topología y función de VP5 en cultivo de células aviares.