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IntroducciónLa Antártida constituye uno de los ambientes más extremos de la Tierra. El clima es el más frío y seco conocido en el planeta. Sin embargo, no es uniforme en todo el continente, y se pueden distinguir diferentes regiones climáticas. Las condiciones extremas que presenta el continente constituyen factores limitantes o condicionantes para la vida vegetal y animal. Por lo tanto, la biología de la Antártida, más que en otros continentes, está dominada por microorganismos, con un alto nivel de adaptación de sus procesos celulares vitales que les permite prosperar en ambientes con temperaturas cercanas al punto de congelamiento del agua (D'Amico y col. 2006, Ruisi y col. 2007). Este nivel de adaptación a condiciones extremas presupone una contribución esencial de estos microorganismos en el reciclaje de nutrientes y la mineralización de la materia orgánica en los ecosistemas, mayormente oligotróficos, de clima frío extremo. ). Estas capacidades metabólicas las realizan a través de una clase especial de enzimas extracelulares denominadas genéricamente "enzimas frías" (Gerday y col. 2000), las cuales tienen una alta eficiencia catalítica a temperaturas inferiores a 20°C y pueden mostrar especificidades de sustrato inusuales. Los productos biológicos de estos microorganismos sicrófilos son candidatos muy atractivos para su aplicación en procesos industriales que requieren actividades enzimáticas a bajas temperaturas. Entre ellos se incluyen amilasas, proteasas y lipasas, que se utilizan ampliamente en las industrias de alimentos, biocombustibles y detergentes (Margesin y Feller, 2010). La Antártida representa uno de los sitios más adecuados para la búsqueda y el estudio de microorganismos psicrófilos, ya que la misma se encuentra casi permanentemente sometida a temperaturas que no superan los 10C. Sin embargo, su situación geográfica, su difícil acceso e incluso el tratamiento internacional a nivel diplomático y político de sus tierras y mares, la hacen una región aún muy poco explorada en cuanto a su biodiversidad microbiana. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo del presente estudio fue el aislamiento, identificación y caracterización de una colección de 52 aislamientos de hongos psicrófilos/psicotróficos provenientes de suelos con características diferentes obtenidos de Península Potter y Península Barton (Isla 25 de Mayo, Shetlands del Sur). En este trabajo la atención se centró sobre la capacidad de los aislamientos de producir las siguientes exoenzimas: amilasa, celulasa, pectinasas, proteasas y esterasa Materiales y MétodosSe recolectaron muestras durante el verano austral 2013-2014 en los alrededores de la Estación de Investigación Científica Argentina Carlini, ubicada en la Isla 25 de Mayo (62 ° 14'18 "S, 58 ° 40'00 "W). Se tomaron 31 muestras del suelo, liquen, musgo, Deschampsia spp. y fango en condiciones estériles. Para el aislamiento se utilizó el protocolo descripto por Fernández y col. (2017).La identificación de los aislamientos se realizó mediante la amplificación de la región D1/D2 del gen del ARNr 26S. Para la extracción del ADN genómico se utilizó un kit comercial (FastDNA ? Spin Kit, MP Biomedicals). La amplificación se llevó a cabo según Martorell y col. (2017). La identificación de las cepas se realizó por comparación de los amplicones con las cepas depositadas en GenBank (tipo y no tipo) y UNITE.Todas las actividades enzimáticas se evaluaron en medio sólido, a 15°C, luego de 5 días de cultivo. La actividades amilasa, celulasa y xilanasa se evaluaron en medio YM (Yeast Morfology Medium) sin glucosa y adicionado con almidón (0,2%), CMC (0,5%) o xilano (0,5%), respectivamente. Las actividades amilasa y xilanasa se detectaron mediante tinción con solución de Iodo/Ioduro, mientras que la actividad celulasa se detectó mediante tinción con Rojo Fenol-NaOH. Lipasas y proteasas se evaluaron en medio YM 1/10 con aceite de oliva (2% v/v) y rodamina B (en el caso de la actividad lipasa) y con leche descremada en polvo (1%) para la actividad proteasa. Para detectar actividad lipasa las placas fueron expuestas a radiación UV y aquellas colonias que presentaran fluorescencia naranja se consideraron positivas. Para detectar actividad proteolítica, se evaluó la formación de halos traslúcidos alrededor de las colonias. La actividad esterasa se ensayó en un medio adicionado con Tween 80. Se consideraron positivas para esterasa aquellas colonias que presentaron un precipitado blanco alrededor de las colonias. La actividad lacasa se evaluó en medio mínimo con ABTS. Todas las técnicas se realizaron según Martorell y col. (2017). El efecto de la temperatura sobre el crecimiento de las cepas seleccionadas se investigó en placas de agar papa-glucosa (Britania). Las placas se incubaron a 5, 15, 25 y 35°C y se monitoreó el crecimiento (como el diámetro de la colonia en mm) hasta los 21 días.ResultadosSe obtuvieron 52 morfotipos de hongos como cultivos puros. Al analizar la naturaleza de las muestras, fue notorio que la mayoría de los aislamientos provenían de las muestras con mayor contenido de materia orgánica: 34% de los aislamientos (n=18) fueron obtenidos de líquenes, musgos y Deschampsia spp; 28% (n=15) de matrices con alto contenido de compuestos orgánicos, como tierra o lodo con heces de pingüinos, plumas, madera de naufragios, cuerpos de focas en descomposición; otro 28% (n=15) de suelos cercanos a la estación y, por consiguiente, con perturbación antropogénica, como los que se encuentran cerca de la salida de la cocina o cerca de los depósitos de combustible; por último, solo un 8% (n=4) se aisló de suelos prístinos.A partirde los 52 aislamientos se identificaron doce géneros diferentes. Siete taxones pertenecieron al filo Ascomycota (Cadophora, Helotiales, Monographella, Oidodendron, Penicillium, Phialocephala, Phialophora, Phoma y Pseudogymnoascus), un taxón al filo Basidiomycota (Irpex) y dos taxones al filo Mucoromycota (Mortierella y Mucor). No se pudieron identificar a nivel de género nueve de los aislamientos.Del total, sólo 27 aislamientos se identificaron a nivel de especie (seudogymnoascus pannorum, Cadophora malorum, Monographella lycopodina, Mucor zonatus, Mucor hiemalis, Penicillium kojigenum). Para el resto solo se alcanzó una identificación a nivel de género, necesitándose más estudios y la secuenciación de otros genes para alcanzar la identificación a nivel de especie.En cuanto a las actividades enzimáticas, la actividad xilanasa fue producida por el 90% (n=47) de los aislamientos, representando la actividad más abundante. La actividad celulolítica fue evidenciada por el 81% (n=42) de los aislamientos y la actividad proteasa en el 79% de los mismos (n=41). Además, la actividad amilasa fue detectada en el 77% de los aislamientos (n=40), la actividad lipasa en el 71% (n=37) y la esterasa (otra enzima lipolítica) sólo en el 52% (n=27). Por último, lacasa, una enzima lignocelulolítica mayormente producida por hongos basidiomicetos, se detectó en sólo un 36% de los aislamientos (n=19).Con respecto a la temperatura de crecimiento, un 23% (n=12) de los hongos se clasificaron como psicrófilos, ya que no crecieron a 25 o 35°C y el 77% restante (n=40) se clasificó como psicrotróficos. Entre éstos últimos, cinco pudieron crecer a 35°C. La temperatura óptima de crecimiento fue de 15ºC para el 64% (n=33) de los aislamientos y 25ºC para el 31% (n=16). Solo un hongo (Mortierella sp. CAV1-348) creció mejor a 5ºC. Mucor zonatus CAV1- 23 y Mucor hiemalis CAV1-237 presentaron el mismo crecimiento en el rango 5-25ºC.DiscusiónEl género Pseudogymnoascus, antes conocido como Geomyces, ha sido reportado como uno de los grupos de hongos aislado con mayor frecuencia en la Antártida (Ding y col. 2016). En concordancia con esto, en este trabajo miembros de éste género fueron aislados de la mayoría de las muestras. De los 19 aislamientos de Pseudogymnoascus pannorum obtenidos, seis fueron capaces de producir todas las enzimas ensayadas. Los hongos con una amplia competencia enzimática poseen alta versatilidad eco-nutricional, la capacidad de sobrevivir en estado vegetativo y superar los cambios ambientales que normalmente podrían ser dañinos, lo que aumenta las posibilidades de supervivencia en ambientes desfavorables (Cooke y Rayner 1984). Estas características los hacen especialmente adecuados para proliferar en ecosistemas como los de Península Potter, donde predominan los gradientes nutricionales y muy cambiantes condiciones de temperatura y humedad. Al igual que Pseudogymnoascus, el género Penicillium es un hongo filamentoso frecuentemente aislado de suelos antárticos (Arenz y col. 2011). Hasta donde sabemos, este trabajo representa el primer reporte de aislamientos del hongo psicrotrófico Penicillium kojigenum (cepas CAV1-11 y CAV1-21) en Antártida. Otros dos aislamientos que fueron clasificados como psicrotróficos, no lograron ser identificaros a nivel de especie (Penicillium sp. CAV1-142 y CAV1-331). En conjunto, esta información contribuye al conocimiento de los miembros del género Penicillium adaptados a baja temperatura en todo el mundo.La clase Leutuomycetes estuvo representada por cinco aislamientos pertenecientes al género Phialocephala. Todos ellos fueron aislados de suelo y presentaron la mayoría de las actividades enzimáticas evaluadas. Dos de los aislamientos (Phialocephala sp. CAV1-225 y CAV1-230) fueron capaces de crecer, aunque pobremente, a 35ºC, sugiriendo una versatilidad térmica poco usual para organismos adaptados a las bajas temperaturas.Entre los Mucorales, Mortierellaceae y Mucoraceae son las familias más frecuentemente citadas para la Antártida (Ruisi y col. 2007). En este trabajo se aislaron miembros de dos géneros (Mortierella y Mucor) pertenecientes a éstas familias. Los miembros del género Mortierella(CAV1-145 y CAV1-348) fueron aislados de musgos y suelo con un contenido orgánico elevado. Estos aislamientos se clasificaron como psicrófilos y presentaron dos de las siete actividades enzimáticas evaluadas: celulasa y lipasa. Las otras cepas de Mucoromycota aisladas fueron Mucor hiemalis CAV1-237 y Mucor zonatus CAV1-23, las cuales mostraron un comportamiento psicrotrófico y mostraron buen crecimiento a 35ºC. Los hongos pertenecientes a este género fueron previamente aislados y reportados en la Antártida (Gesheva & Negoita 2012). Sin embargo, este trabajo constituye el primer reporte de Mucor zonatus en el continente antártico.Dos aislamientos caracterizados como psicrotroficos, que presentaron seis de las siete actividades enzimáticas fueron identificados como Cadophora malorum (CAV1-226 y CAV1-232). Otros cuatro aislamientos psicrotróficos (CAV1-332, CAV1-179, CAV1-229 y CAV1-337), se clasificaron como como Phialophora sp. La presencia de especies previamente reportadas de Cadophora en la Antártida, y la prevalencia de las mismas en muchos lugares de ese continente apoyan lo postulado por Blanchette y col. (2004) acerca del carácter indígena de estos hongos.Otros géneros previamente aislados de diferentes substratos de ambientes antárticos (Godinho y col. 2013) fueron identificados en este trabajo, como Phoma sp. CAV1-327 y Oidiodendron sp. CAV1-302, aislados de líquenes y musgos. Ambos aislamientos mostraron un comportamiento psicrotrófico. En el caso de Irpex sp. CAV1-342, un integrante de este género fue previamente identificado en un suelo antártico cercano al Monte Erebus (Connell & Staudigel, 2013).Los aislamientos identificados como Monographella lycopodina (CAV1-14 y CAV1-20) también representan una novedad, ya que sería el primer registro de la presencia de este género en la Antártida.Finalmente, los hongos no identificados podrían representar especies nuevas. Sin embargo, son necesarios estudios morfológicos y taxonómicos adicionales para identificarlos.En concordancia con lo publicado por Lo Giudice y col. (2010), nuestros resultados sugieren que la mayoría de los hongos de la Antártida Marítima son psicrótróficos. La abundancia de hongos psicrotróficos en suelos superficiales de ambientes fríos es atribuible a las notorias fluctuaciones de temperatura, tanto estacionales como diurnas observadas en estas regiones. Este efecto, causado por la radiación solar, favorece la dominancia de los microorganismos adaptados al frío con carácter euritérmico por sobre los estenotérmicos, representados por los psicrófilos estrictos (Robinson 2001).ConclusiónEn este estudio se evaluó la identidad y la producción enzimática en medios sólidos de 52 cepas de hongos cultivables aislados de diferentes ambientes de la Isla 25 de Mayo, Antártida. En coincidencia con investigaciones previas, encontramos algunos taxones fúngicos endémicos de esta región, adaptados al frío y otros más cosmopolitas. Además, se encontraron taxones que no se habían reportado previamente para la Antártida (Monographella lycopodina, Mucor zonatus, Penicillium kojigenum) y varios aislamientos de hongos no completamente identificados, que se pretende investigar más profundamente en el futuro. El aislamiento de hongos mayoritariamente psicrotróficos con al menos una actividad enzimática a baja temperatura aumenta su potencial utilidad en el desarrollo de procesos biotecnológicos/industriales a temperaturas bajas y moderadas. La observación de patrones de crecimiento en función de la temperatura obtenidos en este trabajo abre la pregunta acerca de si la clasificación psicrófilo/psicrotolerante propuesta por Morita (1975) es suficiente para agrupar adecuadamente a estos microorganismos.

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