EMPLEO DE DOS MÉTODOS MICROCOLORIMÉTRICOS PARA LA DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE ACTIVIDAD EXO Y ENDOPOLIGALACTURONASA

BYRNE, CHRISTIAN E.; CAVALITTO, SEBASTIÁN F.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Micología; 2014

Las poligalacturonasas (PGasas) son enzimas que catalizan la hidrólisis del ácido poligalacturónico (APG). Éstas se dividen en endo-PGasas, que hidrolizan el APG a través de un mecanismo de ataque al azar, produciendo cadenas más pequeñas, y en exo-PGasas, que lo hacen a través de un mecanismo terminal de ataque, liberando monómeros de ácido galacturónico (AGA). Los métodos tradicionales usados para determinar la actividad PGasa, tales como el método colorimétrico de Somogyi-Nelson (SN), se basan en la medida de los extremos reductores liberados tras la hidrólisis del APG, y por ello resultan incapaces de diferenciar entre las actividades exo y endo. Se ha descrito un método colorimétrico para cuantificar la actividad endo, basado en la precipitación de un complejo que forma el APG con el colorante rojo de rutenio (RR). En presencia de una endo-PGasa el APG es hidrolizado a fragmentos de menor tamaño que no pueden ser precipitados al interaccionar con el RR, causando un incremento de colorante en el sobrenadante. La medida espectrofotométrica del exceso de RR en el sobrenadante permite determinar la actividad endo-PGasa. El mecanismo de hidrólisis del APG por exo-PGasas impide determinar la actividad de las mismas por este método, lo que permite diferenciar estas dos actividades. Por lo tanto, en mezclas complejas puede emplearse el método de SN para determinar la actividad PGasa total, y el método de RR para la medida de la actividad endo. Por diferencia se determina la actividad exo.Se estudió cuán efectivo es este procedimiento para la medida de actividades en mezclas exo/endo de composición conocida. Las enzimas empleadas fueron exoPG1 y endoPG1 de Aspergillus kawachii.Las actividades enzimáticas se midieron en buffer acético-acetato 20 mM pH 4,0 y 37°C, empleando PGA 0,18% como sustrato. Para determinar la actividad endo se preparó en eppendorf una serie de soluciones con una concentración constante de RR (0,0036%) y niveles variables de APG (soluciones patrones que proporcionan 0, 3, 6, 9, 18, 24 y 36 ug, o bien 20 ul de mezcla de reacción), en un volumen final de 1 ml. Se agitó en vórtex para facilitar la formación del precipitado. Se centrifugó 5 min a 10000 rpm y se midió la absorbancia del sobrenadante a 535 nm. Se construyó una curva de calibración que permite calcular los ug de APG consumidos en virtud de la absorbancia del sobrenadante. Por otra parte, se determinó la correlación existente entre los ug de APG consumidos y los ug de AGA liberados, medidos con el método de SN.En las mezclas se comprobó una buena correlación entre la actividad endo adicionada y la calculada a partir del método de RR. La actividad PGasa total, y por ende la actividad exo calculada, resultó ser un 20% menor a la adicionada. La diferencia radica en que cuando se determina la actividad exo en presencia de la enzima endo, el sustrato, inicialmente APG, pasa a convertirse en una mezcla de oligómeros, por los cuales la enzima exo presenta una menor afinidad.