CARACTERIZACIÓN DE DOS EXOPOLIGALACTURONASAS ÁCIDAS INDUCIBLES DEL HONGO ASPERGILLUS KAWACHII

BYRNE, CHRISTIAN E.; VOGET, CLAUDIO E.; CAVALITTO, SEBASTIÁN F.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología; 2013

Introducción El hongo filamentoso Aspergillus kawachii IFO 4308 se caracteriza por producir poligalacturonasas (PGasas) con la interesante propiedad de ser activas y estables a valores pH tan ácidos como 2,2. Cuando este hongo se cultiva en un medio líquido a base de sales, triptona y pomaza de limón (rica en pectinas) como fuente de carbono, se induce la síntesis de al menos dos PGasas ácidas que actúan mediante un mecanismo exo. El presente trabajo tiene el objetivo de purificar y determinar distintas características bioquímicas de estas exopoligalacturonasas. Materiales y métodos A. kawachii se cultivó en un medio mineral líquido usando pomaza de limón como fuente de carbono. El cultivo se realizó en erlenmeyer agitado a 30°C y 200 rpm durante 30 hs en oscuridad. Una vez finalizado, el cultivo se filtró través de tela muselina y filtros de nitrato de celulosa, se concentró por evaporación a presión reducida y se sometió a una serie de separaciones cromatográficas de intercambio iónico y exclusión molecular con un equipo ÄKTA-FPLC. La actividad PGasa se determinó empleando ácido poligalacturónico (APG) como sustrato y midiendo el incremento de grupos reductores por el método de Somogyi-Nelson. Se analizaron los distintos pasos del proceso de purificación mediante SDS-PAGE. También se realizó un isoelectroenfoque y una tinción de ácido periódico-Schiff (PAS) para determinar el eventual carácter glicoproteico de las enzimas. El mecanismo de acción sobre APG se determinó a través del análisis de los productos de hidrólisis mediante cromatografía en capa fina. Finalmente, estas enzimas se sometieron a una digestión tríptica y se analizaron por MALDI-TOF MS/MS.Resultados y conclusiones El filtrado de un cultivo de A. kawachii con pomaza de limón como fuente de carbono posee actividad PGasa a pH 2,2. Las separaciones cromatográficas permitieron aislar dos exopoligalacturonasas inducibles: exoPGI (que es la que se encuentra en mayor proporción) y exoPGII. El peso molecular estimado por SDS-PAGE fue de 75 kDa para exoPGI y 80 kDa para exoPGII. El isoelectroenfoque indicó un punto isoeléctrico en el rango de pH de 4,0 a 4,65 para la exoPGI y de 4,5 a 5,0 para la exoPGII. La tinción de PAS permitió demostrar que estas enzimas se tratan de glicoproteínas. Ambas enzimas son activas entre pH 2,2 y pH 6,0, siendo el pH óptimo para APG de 3,5 para la exoPGI y de 4,0 para la exoPGII. El único producto soluble liberado en la hidrólisis de APG por estas enzimas fue el ácido galacturónico, lo que indica que se tratan de típicas exopoligalacturonasas fúngicas. El análisis por MALDI-TOF determinó que la exoPGI presenta similitudes estadísticamente significativas con la exopoligalacturonasa X de A. tubingensis, mientras que la exoPGII lo hace con la exopoligalacturonasa B de A. niger. Estos resultados indican que estas enzimas de A. kawachii presentan homología de secuencia con otras exopoligalacturonasas bien conocidas del género Aspergillus.