Formación de los gránulos intracitoplasmáticos de biopolímero bacteriano polihidroxialcanoato

YASHCHUK O; NYGAARD D; HERMIDA E

Congreso; V Congreso Argentino de Microscopia; 2018

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) constituyen un grupo de biopoliésteres atractivos para aplicaciones industriales por sus propiedades termoplásticas, de biodegradación y biocompatibilidad. Son producidos por microorganismos que, cuando se los cultiva en un medio con exceso de carbono y limitación de algún nutriente, lo almacenan como material de reserva. Los PHAs se acumulan en el citoplasma en forma de gránulos de estructuras amorfas, dinámicas, bastante complejas, que pueden considerarse como organelos bacterianos. Para una detección simple de los gránulos se utiliza la técnica de microscopía óptica con tinciones específicas de colorantes de naturaleza lipofílica. Sin embargo, para describir con precisión la estructura física de las inclusiones lípidicas bacterianas se emplean microscopios electrónico de barrido, transmisión o de fuerza atómica. El objetivo de este trabajo es observar y describir los gránulos de PHAs formados en dos tipos de bacterias con capacidad de acumular el biopolímero: Cupriavidus necator (Gram negativa) y Bacillus cereus (Gram positiva). Los experimentos de acumulación de polímero se realizaron cultivando las bacterias en un medio de sales minerales con fructosa como fuente de carbono. Se sacaron las muestras para la tinción con Sudan Black 0,3% con la posterior observación de los extendidos en el microscopio óptico 1000x. Para obtener las muestras para microscopía de transmisión (TEM) los cultivos se centrifugaron y se enjuagaron con buffer fosfato 0,1M a pH 7,4. Se realizó una primera fijación durante 4hs a 4°C con glutaraldehído 2,5% y una segunda fijación, con tetróxido de osmio al 1% durante 60 min a 4°C. Entre fijaciones se realizaron los lavados con el buffer y agua bidestilada. Se procedió a la deshidratación del material en alcoholes ascendentes y acetona. La inclusión se realizó en resina epoxy ?Durcupan? con polimerización a 60°C durante 72 hs. Para observar las muestras al TEM se realizaron cortes ultrafinos de 70-90 nm de espesor con ultramicrótomo con navaja de vidrio. Los cortes se montaron en grillas de cobre, se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las muestras se observaron al MET Zeiss 109 con cámara Gatan W10000. Según las microscopías realizadas ambos tipos de bacterias acumularon gránulos intracitoplasmáticos de PHAs. En el caso de la coloración con Negro Sudan, los gránulos se tiñeron de color azul intenso y el resto de citoplasma rosado. Las micrografías TEM de B.cereus de 24 hs de cultivo mostraron gránulos de PHAs dispersos en la citosol. La cantidad máxima de gránulos ascendió a 12/bacteria; el tamaño de los gránulos varió entre 0,2-0,6 µm. Se observó también la zona de formación del septo esporal y el desarrollo de la preespora bacteriana. Las micrografías TEM de C.necator cultivado durante 72 hs revelaron la formación de 2 a 4 gránulos de PHAs de forma esférica con diámetro máximo de 0,3 µm. Se observó la coalescencia de gránulos, que podían dar lugar a un granulo único de 0,7 µm. Como conclusión se destaca la utilidad de la microscopía TEM para detección y seguimiento de la acumulación de PHAs en la estructura de bacterias tanto Gram (+) como Gram (-). Además esta técnica contribuye a la determinación de la morfología de los gránulos del biopolímero y permite cuantificar el volumen acumulado, indispensable para la evaluación de la productividad del proceso de producción.