INVESTIGADORES
GONZALEZ MAGLIO Daniel Horacio
congresos y reuniones científicas
Título:
Purificación de autoanticuerpos anti-ribonucleoproteínas Ro/SS-A 52 y 60 de pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas
Autor/es:
PAZ, MARIELA L; GONZALEZ MAGLIO, DANIEL H; LEONI, JULIANA
Lugar:
Buenos Aires, Argentina.
Reunión:
Simposio; Avances en Inmunología Básica y Aplicada: de la mesada a la clínica; 2008
Resumen:
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Purificación de
autoanticuerpos anti-ribonucleoproteínas Ro/SS-A 52 y 60 de pacientes con
enfermedades autoinmunes sistémicas.
Mariela L. Paz; Daniel H. González Maglio y Juliana Leoni.
Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
UBA.
Introducción
Las enfermedades autoinmunes
sistémicas son un grupo de patologías también conocidas como enfermedades del
tejido conectivo o enfermedades autoinmunes reumáticas. Este grupo de
enfermedades incluye el Lupus Eritematoso (LE), en sus distintas variantes, el
Síndrome de Sjögren (SS), la Artritis Reumatoidea (AR) y otras menos frecuentes
como la dermato/polimiositis y la esclerodermia. Una de las características
principales de las patologías mencionadas es la presencia de autoanticuerpos
contra distintos antígenos nucleares en el suero de los pacientes. Dentro de
los antígenos nucleares reconocidos se encuentra el ADN simple y doble cadena
(reconocido principalmente en el Lupus), proteínas asociadas al ADN como las
histonas o la ADN topoisomerasa I y complejos mixtos de proteínas y moléculas
de ARN (no codificante) denominadas ribonucleoproteínas (RNP). Dentro de estos
últimos autoantígenos se destacan las pequeñas RNP nucleares (small nuclear RNP o snRNP) compuestas por el antígeno Sm (formado por 7 polipéptidos) y
una molécula de ARN (U1, U2, U4/U6 o U5); las RNP nucleares (nRNP) y, por
último, el complejo RoRNP que se encuentra formado por dos proteínas (Ro/SS-A
60 y La/SS-B) que interaccionan directamente con una molécula de ARN (hYRNA) y
una tercer proteína (Ro/SS-A 52) que interactúa con el complejo a través de la
proteína Ro/SS-A 60. Las 2 proteínas Ro/SS-A (52 y 60) son reconocidas por
autoanticuerpos con alta incidencia en SS 1º y en menor proporción en pacientes
con SS 2º, LES y AR.
Dentro de las manifestaciones
clínicas más comunes de los pacientes con LES se encuentra la fotosensibilidad
cutánea (FC), caracterizada por una reacción inflamatoria exacerbada luego de
exposiciones cortas a la luz solar. El mecanismo propuesto para el desarrollo
de esta reacción inflamatoria involucra la relocalización desde el núcleo hacia
la membrana plasmática de los autoantígenos Ro/SS-A durante los procesos de
muerte celular por apoptosis de queratinocitos luego de exposición a radiación
UV. Esta relocalización permite que una célula apoptótica (que no genera
inflamación del tejido) sea reconocida por los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A circulantes
y desencadene una reacción inflamatoria. Sin embargo, los pacientes con SS 1º
no presentan FC, a pesar de poseer altos niveles de autoanticuerpos
anti-Ro/SS-A. Si bien existe mucha controversia sobre la hipótesis del
mecanismo de desarrollo de la FC, no existen trabajos realizados con los
autoanticuerpos anti-Ro/SS-A aislados, si no con sueros de pacientes con
diferentes patologías.
El objetivo del presente trabajo es
purificar los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A 52 y 60 (individualmente) a partir
de pacientes con diferentes patologías autoinmunes sistémicas seleccionados
previamente.
Materiales y Métodos
Los sueros de pacientes fueron
remitidos por el servicio de Reumatología del Hospital de Clínicas José de San
Martín, donde, además, se registraron las manifestaciones clínicas de los
pacientes. Sobre un total de 184 pacientes (sobre los que se estudió el nivel
de autoanticuerpos y su relación con la FC) se seleccionaron para la
purificación de anticuerpos 10 pacientes con las siguientes características:
Ro/SS-A 52 y 60 +
Fotosensibilidad +
Fotosensibilidad -
2 LES
2 SS 2º LES
1 LES
1 SS 2º LES
2 SS 2º AR
2 SS 1º
Para la purificación de los
autoanticuerpos se utilizaron las proteínas recombinantes humanas Ro/SS-A 52 y
60, expresadas individualmente en E. coli
BL21 pLys utilizando un plásmido pET 22b. Las proteínas fueron purificadas a
través de su cola de histidina con una matriz de Sepharosa-Niquel. Una vez
purificadas fueron unidas covalentemente a una matriz de Sepharosa activada con
bromuro de cianógeno (1 ml), cuyos sitios activos remanentes fueron bloqueados
con glicina (Gly).
Para la purificación se sembró el suero
diluido en PBS, se realizaron 3 lavados de 4 ml con PBS; luego 4 lavados de 2
ml con PBS+0.5 M ClNa y finalmente se realizó la elución de los autoanticuerpos
en 2 condiciones sucesivas: la primera con Gly-ClH 0.15M ClNa 1M pH 3.5 y la
siguiente con el mismo buffer pero de pH 2.7. Las muestras de eluído fueron
colectadas sobre 0.1 ml de Tris 1M pH 8.5 para neutralizar inmediatamente el pH
ácido.
Todas las muestras fueron analizadas
por ELISA utilizando las proteínas recombinantes Ro/SS-A 52 y 60 purificadas (individualmente)
como antígenos.
Resultados
Se purificaron exitosamente los
autoanticuerpos anti-Ro/SS-A 52 y anti-Ro/SS-A 60 en todos los pacientes
seleccionados. La eficiencia del proceso de purificación se determinó mediante
el descenso en el título de autoanticuerpos por ELISA en los sueros pre y
post-purificación. Para el antígeno Ro/SS-A 52 fue necesario recurrir a una
recromatografía del suero en 3 de los 10 sueros purificados, mientras que para
el antígeno Ro/SS-A 60 fue necesario recromatografiar 4 sueros.
Los autoanticuerpos purificados se
encontraron mayoritariamente en el eluído de pH 3.5, mientras que sólo en
aquellos sueros de alto título se pude evidenciar la presencia de anticuerpos
en el eluído de pH 2.7. Para todos los autoanticuerpos purificados se observó que
no existe reacción cruzada entre los antígenos Ro/SS-A, demostrando también de
esta forma la eficiencia del proceso de purificación.
Conclusiones
La purificación de autoanticuerpos a
partir del suero de pacientes con diferentes patologías autoinmunes sistémicas
fue efectiva. Es posible purificar los anticuerpos y mantener su actividad
bioloógica, aún después de una elución ácida. Sin embargo, en aquellos sueros
de muy alto título contra los antígenos Ro/SS-A 52 y 60 no fue suficiente con
un único ciclo de purificación, si no que fue necesario recromatografiar la
muestra para lograr una purificación apropiada.
Los autoanticuerpos purificados
serán utilizados en estudios posteriores para poder determinar si juegan un rol
importante en los mecanismos de desencadenamiento de la fotosensibilidad
cutánea.