Detección de la enzima KPC mediante PCR en tiempo Real con sondas taqman

MARIELA SCIARA; MARIANA USEGLIO; SILVINA GIUSTINA; FABIÁN FAY

Rosario

Congreso; Expo 6to Congreso Bioquímico Rosario; 2012

Colegio de Bioquímicos de Santa Fe

DETECCION DE LA ENZIMA KPC MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL CON SONDAS TAQMAN.M. Sciara1, M. Useglio1, S. Giustina1, Fay F1. Laboratório CIBIC, Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad. Zeballos 249, Rosario, Santa Fé. Tel.: (0341) 4499444. msciara@cibic.com.arEn la actualidad, la resistencia a carbapenem es un problema emergente a nivel mundial, y la prevalencia de Enterobacterias expresando carbapenemasas se está incrementando de manera alarmante. Las enzimas KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemasas) son unas de las principales enzimas involucradas en la neutralización de los carbapenemes. El gen que codifica para la enzima KPC se halla en un transposón, localizado en un plásmido transferible, otorgándole la capacidad de diseminarse rápidamente. La diseminación de KPC entre Enterobacteriaceae y otras especies Gram-negativas se está volviendo un problema extremadamente serio para el tratamiento de pacientes infectados con estos organismos multiresistentes. La identificación temprana de cepas productoras de carbapenemasas es primordial para la prevención de una diseminación posterior de la resistencia. Con el objetivo de implementar un diagnostico rápido y específico de la presencia del gen que codifica para la enzima KPC en aislamientos bacterianos se puso a punto una PCR en tiempo real con sondas Taqman que permite detectar de manera específica las distintas isoenzimas KPC. Se procesaron muestras de ADN extraídas de colonias bacterianas aisladas de K. pneumoniae y E. coli identificadas previamente como positivas para KPC mediante técnicas moleculares y fisiológicas, y K. pneumoniae, K.oxytoca y E coli sensibles. El ADN plasmídico se extrajo mediante la técnica de lisis cruda y mediante la utilización del kit QIAmp DNA minikit (QIAGEN) según las recomendaciones del fabricante, obteniéndose resultados semejantes con ambos tipos de métodos de extracción. La PCR en tiempo real se llevó a cabo en el equipo LightCycler 2.0 (ROCHE). Para la validación del método se utilizaron cepas de K pneumoniae identificadas y confirmadas como positivas para KPC por el INEI/ANLIS ?Dr. C. Malbrán?. Mediante la PCR en tiempo real puesta a punto se detectó la presencia del gen KPC en todas las cepas identificadas como KPC positivas por métodos fisiológicos combinados. No hubo detección en cepas de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli sensibles, indicando la ausencia de reacciones cruzadas y falsos positivos. El ensayo de PCR en tiempo real descrito provee una herramienta muy útil para identificar rápidamente y de forma precisa la presencia del gen KPC en aislamientos bacterianos. La identificación de este gen de resistencia es un primer paso importante en el control de su peligrosa diseminación.