Estudio de la degradación de la proteína supresora de tumores hDLG mediada por la proteína E6 derivada de HPVs de alto riesgo y su relación con la progresión de lesiones cervicales

G. FUMERO; A. L. CAVATORTA; D. CHOUHY; A. NOCITO; A. GIRI; D. GARDIOL

Rosario

Congreso; V Congreso y XXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario (SBR); 2002

Sociedad de Biología de Rosario

Los Papillomavirus humanos (HPV) infectan células epiteliales y datos epidemiológicos han demostrado que HPV juega un rol causal en el desarrollo de cáncer anogenital. Las proteínas E6 derivadas de HPV de alto riesgo interaccionan con la proteína celular oncosupresora DLG (Discs large), estimulando su degradación por el mecanismo dependiente de ubiquitina. La proteína oncosupresora DLG, interviene en la organización y funcionalidad de las interacciones célula-célula. La desregulación de estas estructuras, conlleva a una defectuosa adhesión celular con pérdida de polaridad, descontrol de la proliferación y alteraciones en el programa de diferenciación. Dadas las funciones de DLG en las células, su degradación mediada por la proteína E6, podría ser considerada una nueva actividad oncogénica de dicha proteína viral. El objetivo de este trabajo consiste en la caracterización y la determinación de la importancia de esta nueva actividad de la oncoproteína E6 en los mecanismos de transformación maligna asociados a HPV. Como primera fase se han preparado anticuerpos policlonales anti-DLG para ser utilizados como herramienta en el estudio de la expresión diferencial de DLG y su relación con los procesos carcinogénicos. Mediante un cuidadoso análisis de comparación de secuencias se eligió una región que no mostraba homología con otras proteínas humanas relacionadas y es única para DLG. El antígeno fue purificado por cromatografía de afinidad hasta homogeneidad y utilizado para inmunizar conejos. Los antisueros obtenidos fueron probados en diferentes ensayos y mostraron un buen grado de especificidad y sensibilidad. Los mismos se utilizaron en experimentos de expresión y localización de la proteína DLG en células en cultivo. Se ha podido corroborar la expresión diferencial de este oncosupresor, utilizando extractos proteicos de líneas celulares derivadas de carcinomas cervicales HPV-positivas como HeLa (HPV-18) y HPV-negativas (HaCat). Los anticuerpos preparados se usaron para observar la localización de DLG mediante técnicas de inmunofluorescencia. Por medio de estos experimentos se observó que DLG localiza en las regiones de uniones intercelulares, en la línea celular HaCat, y con menor nivel de expresión pero con igual localización en la línea celular HeLa. Es importante y necesario establecer la importancia de esta nueva actividad de E6 en infecciones, así como su incumbencia en la evolución y progresión de las lesiones provocadas por HPV. Para ello, los niveles de DLG en cortes histológicos provenientes de biopsias de mucosa cervical serán analizados por inmuohistoquímica, utilizando un anticuerpo monoclonal comercial. Hasta el momento se ha puesto a punto el protocolo respectivo utilizando como muestra tejido normal que no presentaba lesiones correspondientes a infecciones por HPV. Resultados preliminares han demostrado que DLG se expresa, en dicho tejido, en las células de los estratos basales de los epitelios. Se encuentran en curso experimentos similares utilizando cortes histológicos provenientes de lesiones correspondientes a diferentes CIN (neoplasia cervical intraepitelial) asociados o no a HPV. Los datos obtenidos a partir de la ejecución de este proyecto aportarán al conocimiento integral no sólo de la oncogénesis asociada a infecciones por HPV sino de los procesos carcinogenéticos en general.