Desarrollo de ensayos para el diagnóstico molecular de virus de importancia clínica

PEREZ GR; CHOUHY D; BELINKY JJ; TABORDA MA; GIRI AA

Rosario

Congreso; IV Expo Congreso Bioquímico; 2008

Universidad Nacional de Rosario

Los ensayos basados en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) son instrumentos fundamentales para la detección de virus en muestras biológicas debido a su alta sensibilidad, especificidad y rapidez. Sin embargo, es necesario incluir Controles Internos (CI) a fin de monitorear todas las etapas del ensayo (extracción, amplificación y detección) y asegurar la calidad del resultado. Para ello, el CI debe presentar características similares al virus blanco y agregarse a la muestra previamente a su procesamiento. En este trabajo se desarrollaron ensayos moleculares con CI no competitivos y aplicables al diagnóstico de virus con genoma ADN y ARN. Para ello, se seleccionaron el fago P1 (genoma de ADN) y el fago Qb (genoma de ARN) como CI. El fago P1 se propagó y tituló utilizando E. coli RecA+ W3110. El Fago Qb se obtuvo por inducción de células E. coli BL21pLys transformadas con el plásmido pBRT7Qb que contiene el genoma fágico como ADNc bajo el control del promotor T7 y se tituló con E. coli XL1Blue F’. Se diseñaron cebadores y sondas específicos para cada fago. Se optimizaron las reacciones de co-amplificación e hibridación correspondientes a diferentes virus blanco con genoma de ADN (Herpes Virus Simples I/II, Citomegalovirus, Virus Epstein-Barr, Adenovirus) o de ARN (Enterovirus) utilizando el fago P1 o Qb como CI, respectivamente. La optimización se efectuó con ensayos de RCP (o transcripción reversa-RCP), seguidos de hibridización líquida con sondas no radioactivas y detección colorimétrica, previamente desarrollados en nuestro laboratorio. Los ensayos resultantes se utilizaron para analizar 189 muestras (33 sueros, 114 LCR, 21 orinas, 4 biopsias, 7 médulas óseas y 5 separaciones leucocitarias) provenientes de distintos servicios hospitalarios de Rosario. En conclusión, la incorporación de los fagos P1 y Qb como CI en ensayos moleculares es una estrategia efectiva para resolver resultados falsamente negativos causados por inhibición o deficiencias en el proceso de extracción de los ácidos nucleicos de la muestra clínica