Desarrollo de un sistema de PCR colorimétrico para la identificación y tipificación de papillomavirus humanos oncogénicos en muestras biológicas

CHOUHY D; GIRI AA

Rosario

Congreso; IX Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación Universidades Grupo Montevideo; 2001

Asociación de universidades del grupo montevideo

Introducción: Los papillomavirus humanos (HPV) son un grupo de virus que incluye más de 90 tipos virales distintos con tropismo específico por células epiteliales. Aunque muchos de ellos producen lesiones de tipo benigno, los tipos 16 y 18 se encuentran en la mayoría de los carcinomas y por lo tanto, su detección temprana es un factor importante en la prevención de formas neoplásicas. Objetivo: Desarrollo y optimización de un sistema de amplificación génica para la detección y tipificación de los genomas virales de HPV de elevado potencial oncogénico. Metodología: El ensayo presenta las siguientes características: i) amplificación genérica de una porción de L1 de HPV usando el cebador antisentido biotinilado; ii) hibridización líquida del amplicón biotinilado a una sonda conjugada con fluoresceína; iii) inmovilización de los híbridos a una microplaca revestida con estreptavidina; iv) detección con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromóforo; vi) lectura de la producción de color en lector de microplacas; vii) tipificación de las muestras HPV-positivas con sondas específicas para HPV-16 y HPV-18. Resultados: Se utilizó la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) para la amplificación de una porción del gen L1 con los cebadores MY11 y MY09 biotinilado en 5´, en grado de amplificar un fragmento de alrededor de 450 pb de todos los tipos de HPV. Para la optimización de la reacción se prepararon 16 buffers de reacción 10 x, compuestos de todas las combinaciones de pH y MgCl2. Los productos amplificados fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y detección colorimétrica. En esta última, se estableció la concentración óptima de anticuerpo antifluoresceína y se determinaron prácticamente las temperaturas de hibridización para las sondas genérica y específicas para HPV-16. El ensayo resultante permite la co-amplificación de HPV y b-globinas en la misma reacción de PCR para la determinación de secuencias virales y verificar la integridad de la muestra. El protocolo de detección colorimétrica en microplaca permite tanto la identificación genérica de las secuencias HPV-positivas como aquéllas específicas para HPV-16. Conclusiones: Este ensayo provee un sistema sensible, específico, económico y de fácil ejecución para su aplicación en el diagnóstico virológico. Apenas finalizados los experimentos de optimización para la detección de secuencias HPV-18 se evaluará el significado predictivo del ensayo para la identificación de los pacientes a riesgo de desarrollar neoplasias de piel y mucosas