Detección y genotipificación por PCR colorimétrica de papillomavirus humanos oncogénicos en muestras de cepillado cervical

CHOUHY D.; GIRI A

Florianópolis (Brasil)

Congreso; X Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación Universidades Grupo Montevideo; 2002

Asociación de universidades del grupo montevideo

Los papillomavirus humanos (HPV) son un grupo de virus que incluye más de 100 tipos distintos, algunos con tropismo específico por epitelios mucosos. Aunque muchos de ellos producen lesiones de tipo benigno, los tipos 16 y 18 se encuentran asociados a la mayoría de los carcinomas cervicales y por lo tanto, su detección temprana es un factor importante en la prevención de formas neoplásicas. El objetivo de este trabajo es el desarrollo y la optimización de un sistema de amplificación génica para la detección y tipificación de los genomas virales de HPV de alto potencial oncogénico. El ensayo presenta las siguientes características: i) amplificación de una porción de L1 de todos los tipos de HPV usando el cebador antisentido biotinilado; ii) hibridización líquida del amplicón biotinilado a una sonda genérica conjugada con fluoresceína; iii) inmovilización de los híbridos a una microplaca revestida con estreptavidina; iv) detección con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromóforo; vi) lectura de la producción de color en lector de microplacas; vii) tipificación de las muestras HPV-positivas con sondas específicas para HPV-16 y HPV-18. Se optimizó la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) para la amplificación de un fragmento de aproximadamente 450 pb del gen L1 de todos los tipos de HPV, con los cebadores MY11 y MY09 biotinilado en 5´. Para la optimización se prepararon 16 buffers de reacción, compuestos de todas las combinaciones de pH y MgCl2. Los productos amplificados fueron detectados como detallado anteriormente. Se estableció la concentración óptima de anticuerpo antifluoresceína y se determinaron prácticamente las temperaturas de hibridización para cada sonda (genérica y específicas). La sensibilidad analítica del ensayo fue de 5x10-4 genomas de HPV-16/célula y de 2x10-3-0.01 genomas de HPV-18/célula. La técnica fue convalidada con 31 muestras de cepillado cervical. Las células fueron lavadas con buffer fosfato, lisadas por 12 hs a 55°C con una solución con detergentes no iónicos y proteinasa K. HPV fue detectado en el 64% (20/31) de las muestras, de las cuales el 35% (7/20) fueron positivas para HPV-16 y el 5% (1/20) para HPV-18. Los resultados obtenidos indican el ensayo molecular como un sistema de mayor sensibilidad respecto al exámen citológico en la detección temprana de pacientes infectadas con HPV. El análisis de un mayor número de pacientes permitirá evaluar el significado predictivo del ensayo para identificar pacientes de riesgo de desarrollar neoplasias cervicales.