Desarrollo de un sistema de PCR colorimétrico para la identificación y tipificación de papillomavirus humanos oncogénicos en muestras de cepillado cervical

CHOUHY D; NOCITO AL; MATERA S; BENÍTEZ GIL L; CITTADINI J; CAPPELLO S; DEL FRADE A; TURI A; GARDIOL D; GIRI AA

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología; 2002

Sociedad Argentina de Virología

Los papillomavirus humanos (HPV) son un grupo de virus que incluye más de 100 tipos virales distintos, algunos con tropismo específico por epitelios mucosos. Aunque muchos de ellos producen lesiones de tipo benigno, los tipos 16 y 18 se encuentran asociados a la mayoría de los carcinomas cervicales y por lo tanto, su detección temprana es un factor importante en la prevención de formas neoplásicas. El objetivo de este trabajo es el desarrollo y la optimización de un sistema de amplificación génica para la detección y tipificación de los genomas virales de HPV de alto potencial oncogénico. El ensayo presenta las siguientes características: i) amplificación de una porción de L1 de todos los tipos de HPV usando el cebador antisentido biotinilado; ii) hibridización líquida del amplicón biotinilado a una sonda genérica conjugada con fluoresceína; iii) inmovilización de los híbridos a una microplaca revestida con estreptavidina; iv) detección con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromóforo; vi) lectura de la producción de color en lector de microplacas; vii) tipificación de las muestras HPV-positivas con sondas específicas para HPV-16 y HPV-18. Se optimizó la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) para la amplificación de un fragmento de aproximadamente 450 pb del gen L1 de todos los tipos de HPV, con los cebadores MY11 y MY09 biotinilado en 5´. Para la optimización se prepararon 16 buffers de reacción, compuestos de todas las combinaciones de pH y MgCl2. Los productos amplificados fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y detección colorimétrica, como detallado anteriormente. En esta última, se estableció la concentración óptima de anticuerpo antifluoresceína y se determinaron prácticamente las temperaturas de hibridización para cada sonda (genérica y específicas). La sensibilidad analítica del ensayo fue determinada con diluciones de ADN de líneas celulares derivadas de carcinomas cervicales asociados a HPV-16 (CasKi) o HPV-18 (HeLa), resultando dicha sensibilidad en 5x10-4 y 6x10-3 genomas/célula, respectivamente. Para convalidar la aplicabilidad de la técnica con muestras clínicas se analizaron 30 muestras de cepillado cervical de 29 mujeres provenientes del Servicio de Ginecología del Hospital Provincial del Centenario de la ciudad de Rosario. Las células de cuello de útero fueron lavadas con buffer fosfato y lisadas con una solución conteniendo detergentes no iónicos y proteinasa K e incubación por 12 hs a 55°C. La competencia de las muestras fue determinada mediante amplificación del gen de b-globina y electroforesis en gel de agarosa. Se determinó la presencia de HPV por PCR y detección colorimétrica con sonda genérica en aquéllas muestras que resultaron b-globina-positivas. HPV fue detectado en el 63% (19/30) de las muestras analizadas mientras el 37% (11/30) resultó HPV-negativo. Luego se procedió a tipificar las amplificaciones HPV-positivas con sondas específicas, resultando 7 de ellas positivas para HPV-16 (23%) y una positiva para HPV-18 (3%). Los resultados obtenidos en el ensayo de PCR colorimétrica fueron concordantes con los datos correspondientes al diagnóstico clínico y anátomo-patológico. Este ensayo provee un sistema sensible, específico y de fácil ejecución para su aplicación en el diagnóstico virológico. El análisis de un mayor número de pacientes permitirá evaluar el significado predictivo del ensayo para la identificación de pacientes de riesgo de desarrollar neoplasias cervicales.