Desarrollo de un instrumento para la detección precoz del cáncer cervical

CHOUHY DIEGO; CAVATORTA ANA LAURA; BENITEZ GIL LISANDRO; NOCITO ANA LÍA; CITTADINI JORGE; GARDIOL DANIELA; GIRI ADRIANA A

Buenos Aires

Congreso; Congreso Internacional-Grupo Biotecnología, VI simposio nacional de Biotecnología, REDBIO Argentina 2005, Encuentro Trinacional REDBIO Argentina-Chile-Uruguay; 2005

REDBIO

El cáncer cervical es una de las neoplasias mas comunes que afecta los órganos reproductivos de la mujer. En Latinoamérica ocupa el primer lugar en incidencia, siendo en Bs.As. de 25,4/100.000 mujeres (Golijow, 2005). La prevención del cáncer cervical se basa en la realización periódica del Papanicolaou (Pap) y la colposcopía. Las lesiones cervicales se clasifican según su severidad en lesiones escamosas intraepiteliales de bajo o alto grado (LSIL o HSIL) e invasivas. El Pap ha contribuido a reducir la incidencia del cáncer cervical. Sin embargo, el diagnóstico de neoplasias cervicales en mujeres controladas periódicamente con el Pap sugiere que esta metodología ha llegado al límite de su sensibilidad para la detección precoz. Ha sido establecido que la infección con tipos oncogénicos de papillomavirus humanos (HPV) es el evento clave en el desarrollo del cáncer cervical (Zur Hausen, 1996). Además, las infecciones persistentes con HPV oncogénicos en mujeres con lesiones cervicales aumenta el riesgo de progresión a cáncer en el tiempo. La imposibilidad de cultivar el virus, el escaso significado de las pruebas serológicas y la reducida sensibilidad de la inmunohistoquímica, indica la búsqueda de ácidos nucleicos virales como la mejor estrategia de diagnóstico de HPV. Dada la ausencia en nuestro país de métodos comerciales para la detección de secuencias de HPV, surge la necesidad de desarrollos regionales. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo molecular para la detección de HPV y tipificación de los 5 tipos oncogénicos de mayor incidencia como herramienta para el diagnóstico precoz de cáncer cervical. Metodología: Se desarrolló el L1HPVPCR, un ensayo basado en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con revelado colorimétrico para la detección de HPV mucosotrópicos y tipificación de los HPV oncogénicos de mayor incidencia (16,18,31,33,-35). Se optimizó la técnica de PCR con los cebadores genéricos MY11 y MY09 biotinilado (Manos, 1989), que permiten amplificar un fragmento altamente conservado de la proteína mayor del cápside L1 de los HPV mucosotrópicos. Los amplicones biotinilados son hibridizados en fase líquida a una sonda genérica conjugada a fluoresceína, capturados a una microplaca revestida con estreptavidina y detectados con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromógeno (Figura 1). Las muestras HPV-positivas son tipificadas con sondas fluoresceinadas tipo-específicas para HPV-16,-18,-31,-33 y -35, con un procedimiento similar al descripto para la sonda genérica. La idoneidad de muestras HPV-negativas es verificada mediante amplificación de un fragmento del gen de b-globina humana (Figura 1). Resultados y Discusión: El L1HPVPCR fue sensible (10-100 copias de HPV/reacción), reproducible y de fácil ejecución. Para convalidar su aplicabilidad diagnóstica se analizaron 130 muestras de cepillado cervical (Tabla 1): 94 con citología normal, 24 LSIL y 12 HSIL. El ADN viral fue detectado en el 54% (70/130), de los cuales el 57% (40/70) pertenecía a HPV oncogénicos. El 55% (52/94) de las muestras con citología normal, fue concordante en el ensayo molecular. Un resultado doble-negativo (citología normal y ausencia de ADN de HPV oncogénico) indica mejor pronóstico contra futuras lesiones HSIL que tres resultados negativos consecutivos en la citología. El 45% (42/94) restante de las muestras con citología normal presentó secuencias de HPV, detectándose tipos oncogénicos en el 21% (20/94) de las mismas. Mujeres con citología normal que resulten positivas al ADN de HPV oncogénicos presentan un riesgo 100 veces mayor de desarrollar HSIL, respecto a las mujeres negativas para ambas determinaciones. Entre las muestras que presentaron LSIL, el 75% (18/24) fue positiva para HPV, tipificándose HPV oncogénicos en el 42% (10/24). Todas las muestras HSIL que presentaron secuencias de HPV (83%; 10/12) correspondieron a tipos oncogénicos. La regresión de las lesiones siempre tiene lugar posteriormente a la erradicación viral, lo cual podría explicar el resultado negativo para HPV en 6 de las muestras LSIL y 2 HSIL. Además, el L1HPVPCR fue utilizado para demostrar la asociación de HPV en muestras de tejidos embebidos en parafina de mucosa cervical. Este análisis permitió correlacionar la degradación del oncosupresor h-Dlg por la oncoproteína E6 de HPV oncogénicos con los procesos de transformación maligna en el trabajo publicado por nuestro grupo (Cavatorta, 2004). Conclusiones: Estos resultados indican al L1HPVPCR como una herramienta de alta sensibilidad para la detección precoz del cáncer cervical. Considerando la falta de acceso a los ensayos de detección y tipificación de HPV comerciales, el ensayo aquí presentado constituye un instrumento de importancia para asegurar la calidad y continuidad de los resultados, y permitir un seguimiento más eficiente de las mujeres con riesgo de desarrollar cáncer cervical.