ESTANDARIZACIÓN DE PROTOCOLO DE OBTENCIÓN Y CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS BLANCAS Y EVALUACIÓN DE RESPUESTAS DE ESTRÉS EN LLAMAS

RAMOS, NE; ODEON, MM; ROMERO, S; ROMERA, SA

Congreso; IV Congreso del Foro de Universidades Nacionales para la Agricultura Familiar (FUNAF); 2018

En Argentina el sector de la Agricultura Familiar, concentra el 66 % de las exploraciones agropecuarias, el 13,5 % de la superficie cultivable, el 53 % de la mano de obra rural y el 20 % del Valor Bruto de la Producción (Censo Nacional Agropecuario 2002). En este tipo de producción el manejo de los recursos no posee niveles tecnológicos importantes y la familia aporta la fracción predominante de la fuerza del trabajo. Al carecer de capital, este sector de producción primaria, se ve afectado por distintos fenómenos que disminuyen la capacidad productiva y limitan la sustentabilidad. La cantidad total de ganado camélido (llamas) en la Argentina es mayor de 160.000 animales, distribuidos principalmente en el altiplano de Jujuy (100.000), y el resto en Catamarca y Salta. Por otro lado nuestro país cuenta con aproximadamente 127.072 vicuñas (SAyDS, 2008), donde la población de Jujuy representaría el 43 % y la de Salta el 18% y 39 % el resto de las provincias vicuñeras (Catamarca, San Juan y La Rioja). En la provincia de Jujuy, la mayoría del ganado camélido y el manejo de vicuñas se encuentran en manos de comunidades campesinas de pequeños productores familiares. La llama y la vicuña comparten su condición de camélidos sudamericanos, poseedores de fibras naturales de finura excepcional. Estas especies muestran diferencias respecto a la modalidad de su aprovechamiento y comercialización en relación a su condición de silvestre o doméstico. En el caso de la vicuña, camélido silvestre solo se comercializa la fibra y la artesanía textil derivada bajo estrictas normas de trazabilidad, a diferencia de la llama (doméstica) que además de la fibra se aprovecha la carne y el cuero.. En la actualidad se cuenta con valiosas experiencias de cooperativas en acopio de fibra de llama; planes de manejo local de fibra de vicuña en ejecución; y artesanas organizadas para la producción y comercialización de artesanías textiles en fibra de llama. Por otro lado existen familias que comercializan la fibra y artesanías de manera individual, en condiciones de desventaja a la hora de negociar los precios, sosteniendo un círculo vicioso de productos de baja calidad y precio. La dificultad de acceder a condiciones de producción más apropiadas conduce entre otras cuestiones a una baja calidad de procesos y productos. Actualmente los sistemas de producción animal y manejo de fauna silvestre deben adaptarse a un nuevo marco legal que incluye un concepto ético de bienestar animal (BA) convirtiéndose este indicador, en diferentes sistemas ganaderos y manejo de fauna, en motivo de creciente preocupación por parte de consumidores y productores. Uno de los puntos críticos más importantes evaluados en la producción de fibras es la esquila, debido a que no se cuenta con suficientes herramientas técnicas apropiadas a camélidos sudamericanos, entre ellas protocolos estandarizados bajo normas de bienestar animal. Por las razones anteriormente mencionadas es importante que el productor adquiera pautas que posicionen a estos productos no solo desde el valor nutricional o comercial sino desde el valor ético. En el área de bienestar animal se abordan estudios relacionados a evaluar el impacto de diferentes situaciones de manejo como la esquila, prácticas sanitarias, y la adecuación de las instalaciones de estas especies. Los efectos del manejo de los animales sobre el bienestar animal se pueden medir a través de indicadores fisiológicos y de comportamiento. Actualmente se concuerda que el BA debe ser evaluado con múltiples variables como la salud, signos fisiológicos de estrés, longevidad, reproducción y comportamiento. En este proyecto abordaremos el estudio del estrés como uno de los principales factores que afectan al bienestar animal. Los cambios ambientales pueden ser percibidos por el sistema nervioso central como amenazas provocando una respuesta inmediata por vía nerviosa en la que el animal reacciona rápidamente iniciando su adaptación. Así, dependiendo de la relación existente entre el animal y su entorno éste se ve forzado a realizar un mayor o menor esfuerzo de adaptación. Los organismos han desarrollado muchas estrategias para defenderse de ambientes y condiciones estresantes. La respuesta inmune es uno de los mecanismos mediante los cuales los animales se defienden contra los desafíos ambientales. Los mecanismos subyacentes de la respuesta inmune al estrés no están claros debido a la complejidad del sistema inmune y la respuesta al estrés, y otros factores tales como la edad, la nutrición, la genética, y el género. Se plantea entonces profundizar los conocimientos en esta línea. Así, con el objetivo de evaluar parámetros bioquímicos y celulares como indicadores de bienestar animal en distintos sistemas de producción de llamas, entre otras especies de camélidos, nos propusimos poner a punto un método eficiente de obtención y preservación de células del sistema inmune (glóbulos blancos) para dicha evaluación. Con la información generada se pretende realizar recomendaciones de manejo bajo las condiciones particulares de las especies animales y de los sistemas rurales locales. La muestra de sangre de llamas para estandarización de obtención y criopreservación de células fue tomada de la vena yugular externa con citrato 3.8% (1:10) como anticoagulante. Se procesaron con diferentes protocolos para la futura evaluación de obtención de glóbulos blancos con cada uno de ellos, con el objetivo de maximizar el número de células obtenidas (cámara de Neubauer), evitando la contaminación de glóbulos rojos (extendido y tinción con Giemsa). La diferencia entre protocolos evaluados consiste principalmente en el método de lisis de glóbulos rojos, ya que al tratarse de camélidos es una de las principales variables a ajustar. Difieren del resto de los mamíferos en que sus glóbulos rojos se encuentran en mayor número (10-18.106/ul) son elípticos y planos, con mayor afinidad por el oxígeno. Se siguió un Protocolo general que consiste en: 1-Centrifugar 1000 g 30 min, separar plasma. 2-LISIS 1(con uno de los métodos de lisis ensayados)3 Centrifugar 1200g 5 min. 4-LISIS2. 5- Centrifugar 1200g 5 min. 6-Lavar con RPMI. 7-Centrifugar 1200g 5 min.8- Resuspender las células en RPMI 10% suero fetal bovino (SFB)Los métodos de lisis ensayados fueron:LISIS Protocolo 1: H2O destilada 1:1, 4°CLISIS Protocolo 2: 5,4 g sacarosa 300 mM en Tris-HCl (pH 7,5) + 0,5 mL Tritón X // 1:1, 5min, 4°CLISIS Protocolo 3: NH4Cl 155 mM; Bicarbonato de potasio 10 mM; EDTA disDTA d 0.1 mM // 1:1, 15 min, 4 °CLISIS Protocolo 4: NH4Cl 155 mM; Bicarbonato de potasio 10 mM; EDTA disDTA d 0.1 mM // 1:1, 15 min, 37°CUna vez estandarizada la obtención de células se trabajó con llamas sometidas a distintos manejos. Con la sangre entera de las llamas se realizaron frotis para tinción con Giemsa y se midió la concentración de glucosa con tiras reactivas. Los valores se expresan en mg/dl. Luego la sangre entera se centrifugo a 1000 g por 30 minutos a 10ºc, se recuperó el plasma y se fracciono en 500 ul con inhibidor Roche 1:5, para luego realizar mediciones de proteínas plasmáticas por el método de LowrySe trabajó con llamas que fueron sometidas a distintas modalidades de esquila. Se trabajo con 10 llamas, cinco fueron sometidas a esquila mecánica (menor a 4 minutos) y cinco a esquila manual (de 9 a 13 minutos). La toma de muestra se realizó en ambos casos inmediatamente post esquila. Respecto de la purificación de glóbulos blancos de llama, luego de analizar el número de células obtenidas y la contaminación de glóbulos rojos presentes se concluye que el protocolo número 4 es el adecuado para la obtención de plasma y la purificación de glóbulos blancos de llama. Únicamente con el protocolo 4 que utiliza cloruro de amonio incubado a 37°C como buffer de lisis se logró una muestra final con un buen rendimiento en la obtención de linfocitos y neutrófilos sin contaminación con glóbulos rojos. La lisis en los protocolos 1 y 3 fue muy baja, mientras que en el protocolo 2 sí se observó lisis de eritrocitos pero también de glóbulos blancos. La mejor combinación fue en el protocolo 4, donde se utilizó un buffer con mayor poder lisante que el 1 pero menor que el 2, a una temperatura que optimice su acción También se logró, siguiendo a la purificación, un método eficiente de criopreservación de células a -80ºC. En cuanto a las diferencias de adaptación a las prácticas de esquila de llamas manual y mecánica los resultados obtenidos indicarían que los animales del grupo esquilado mecánicamente tuvieron menos estrés ya que se observaron menores concentraciones de glucosa (116mg/dl frente a 134mg/dl observados en esquila manual) y más del doble de proteínas totales en las llamas sometidas a estrés manual, datos que se cotejaran en los mismos animales con las mediciones de cortisol y perfil de citoquinas secretado y que aún resta determinar.La propuesta de implementación de protocolos de bienestar animal en los distintos sistemas de manejo aportará en la resolución de parte de las problemáticas de los agricultores familiares e impactará en la sustentabilidad. En particular desarrollar metodologías adaptadas a escenarios locales para la medición de parámetros fisiológicos, bioquímicos y comportamentales como indicadores de bienestar permitirá aumentar la productividad de los camélidos, disminuyendo el estrés en las distintos manejos realizados en estas especies respondiendo con las demandas de un mercado internacional sensible éticamente al maltrato animal y a los requisitos normativos para la conservación y manejo de especies silvestres como el caso de vicuña .