PROCESAMIENTO DE MUESTRA DE SANGRE DE LLAMA: PURIFICACIÓN DE GLÓBULOS BLANCOS

ODEON, MM; ROMERO, S; ROMERA, SA

Encuentro; XXI REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA AAVLD Dr bernando Jorge carrillo; 2016

INTRODUCCIÓNEl aumento de la producción de fibras y demás productos de los camélidos sudamericanos debe ser parte de una estrategia global de inversión sostenida en investigación y desarrollo apropiados. Entre los productos que se comercializan se encuentra la carne, cueros, lana, fibras y artesanías. Todos a través de vías informales de comercialización (mercados de trueques y/o canjes por alimentos no perecederos) de manera individual y a bajos precios (Quispe, 2009). A partir de la década del ?60 ha habido un crecimiento del rodeo de llamas estimulado por factores tales como el involucramiento de las autoridades de las provincias del NOA y de organismos federales e internacionales, que ya consideran la producción de camélidos como un factor de desarrollo regional, pero también por un incremento de las posibilidades de comercialización de fibra y carne que comienza a insinuarse. La cantidad total de ganado camélido en la Argentina es mayor de 160.000 animales, distribuidos principalmente en el altiplano de Jujuy (100.000), y el resto en Catamarca y Salta (Aba, 2005.).Estas especies poseen ventajas comparativas, dado que se desarrollan en áreas agro- ecológicas donde no se adaptan adecuadamente otras especies de interés productivo; así mismo su crianza constituye una actividad socioeconómica sumamente importante para el poblador alto andino (García Fernandez, 1992).En la provincia de Jujuy, la mayoría del ganado camélido se encuentra en manos de comunidades campesinas de pequeños productores familiares cuya actividad principal es la ganadería de altura. Las condiciones de manejo son precarias, de manejo tradicional, carente de tecnología o sistemas racionales de explotación y en la mayoría de los casos la mano de obra es familiar. Debido a las características de dicho manejo se suman a los factores limitantes de la producción las respuestas de estrés y las enfermedades.Por las razones anteriormente mencionadas es importante que el productor adquiera pautas que posicionen a este producto no solo desde el valor nutricional sino desde el valor ético. En el área de bienestar animal se abordan estudios relacionados a evaluar el impacto de diferentes situaciones de manejo como la esquila, prácticas sanitarias, y la adecuación de las instalaciones a estas especies. Los efectos del manejo de los animales sobre el bienestar animal se pueden medir a través de indicadores fisiológicos y de comportamiento.Con el objetivo de evaluar parámetros bioquímicos y celulares como indicadores de bienestar animal en distintos sistemas de producción de llamas, nos propusimos poner a punto un método eficiente de obtención de muestra para dicha evaluación, purificación de glóbulos blancos y su posterior criopreservación. Como producto de estos estudios se pretende generar recomendaciones de manejo bajo las condiciones particulares de los sistemas rurales locales y de las especies animales, ya que hasta el momento no existen muchos antecedentes al respecto. MATERIALES Y MÉTODOSLa muestra de sangre de llamas fue tomada de la vena yugular externa con citrato 3.8% (1:10) como anticoagulante.Luego se procesaron con tres protocolos distintos para la futura evaluación de obtención de glóbulos blancos con cada uno de ellos, con el objetivo de maximizar el número de células obtenidas, evitando la contaminación de glóbulos rojos. Se partió de 500 ul de sangre en cada protocolo, se realizaron por duplicado. La diferencia entre protocolos consiste principalmente en el método de lisis de glóbulos rojos, ya que al tratarse de camélidos es una de las principales variables a ajustar. Difieren del resto de los mamíferos en que sus glóbulos rojos son elípticos y con mayor afinidad por el oxígeno. Para analizar la eficiencia de cada protocolo se realizó un conteo de células con azul de tripan en cámara de Neubauer. Para evaluar pureza de las muestras obtenidas se realizó un extendido de las células, se tiñieron con Giemsa y se observaron al microscopio óptico.Protocolo general: 1-Centrifugar 1000 g 30 min, separar plasma. 2-LISIS 1. 3-Centrifugar 1200g 5 min. 4-LISIS2. 5- Centrifugar 1200g 5 min. 6-Lavar con RPMI. 7-Centrifugar 1200g 5 min. 8- Resuspender células en RPMI-10%SFB.LISIS Protocolo 1: H2O destilada 1:1, 4ºCLISIS Protocolo 2: 5,4 g sacarosa 300 mM en Tris-HCl (pH 7,5) + 0,5 mL Tritón X // 1:1, 5 min, 4ºCLISIS Protocolo 3: NH4Cl 155 mM; Bicarbonato de potasio 10 mM; EDTA disódico 0.1 mM // 1:1, 15 min, 4ºCLISIS Protocolo 4: NH4Cl 155 mM; Bicarbonato de potasio 10 mM; EDTA disódico 0.1 mM // 1:1, 15 min, 37ºC Luego de la purificación, se puso a punto un método de criopreservación de células.RESULTADOSProtocolo 1: Células obtenidas:28 x106 Céls./mlContaminación de eritorocitos: Muy AltaProtocolo 2: Células obtenidas:12 x106 Céls./mlContaminación de eritorocitos: BajaProtocolo 3: Células obtenidas:92 x106 Céls./mlContaminación de eritorocitos: AltaProtocolo 4: Células obtenidas:103 x106 Céls./mlContaminación de eritorocitos: BajaDISCUSIÓNLuego de analizar el número de células obtenidas y la contaminación de glóbulos rojos presentes se concluye que el protocolo número 4 es el adecuado para la obtención de plasma y la purificación de glóbulos blancos de llama. Únicamente con el protocolo 4 se logró una muestra final con un buen rendimiento en la obtención de linfocitos y neutrófilos sin contaminación con glóbulos rojos. La lisis en los protocolos 1 y 3 fue muy baja, mientras que en el protocolo 2 sí se observó lisis de eritrocitos pero también de glóbulos blancos. La mejor combinación fue en el protocolo 4, donde se utilizó un buffer con mayor poder lisante que el 1 pero menor que el 2, a una temperatura que optimice su acción.Se logró, siguiendo a la purificación, un método eficiente de criopreservación de células a -80ºC. BIBLIOGRAFÏA-Aba, M. A.; Quiroga, M.A. y Lamas, H.E. 2005. Manejo sanitario de los Camélidos de la puna jujeña: situación actual y cambios técnicos a implementar. Seminario Int. de Camélidos Domésticos. Gob. de Jujuy-Consejo Federal de Inversiones.-Quispe EC, Rodríguez TC, Iñiguez LR y Mueller JP, 2009. Producción de fibra de alpaca, llama, vicuña y guanaco en Sudamérica. Animal Genetic Resources Information.-García Fernandez, J.J., Tecchi, R. y M. Rabey, 1992. La ganadería de camélidos en el altiplano de Jujuy. Ecosistemas Altoandinos de Argentina y Chile.Memorias.