Estudios de la interacción célula-célula en Kloeckera apiculata mc1 usando ensayos de fluorescencia

OSCAR ANTONIO SOSA; ESTELA NOEMI SANTILLAN; MARIA CRISTINA MANCA DE NADRA; MARTA ELENA FARÍAS

Cordoba, Argentina

Congreso; III CONGRESO INTERNACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS; 2009

Ministerio de Ciencia y Tecnologia y Gobierno de la Ciudad de Cordoba

La autofloculación de Kloeckera apiculata mc1, una levadura no-Saccharomyces aislada de uvas argentinas, está mediada por uniones entre lectinas y residuos de galactosa de la superficie celular, estabilizadas por Ca2+. Demostramos que glucosa induce la expresión de este fenotipo a través de la activación de la “vía de la proteina quinasa A dependiente de cAMP”. En este trabajo se evalúa el efecto de glucosa sobre la densidad de lectinas galactosa-específicas y se cuantifica el número de receptores específicos en K. apiculata mc1, mediante el uso de ligandos glucosídicos conjugados a fluoróforos. Células de K. apiculata precultivadas durante 12 h a 28ºC en medio YMPG pH 5,5, se dispersan con EDTA 50 mM y se inoculan en YMPG2 (2 g/l glucosa) y en YMPG20 (20 g/l glucosa). Se incuban aeróbicamente a 28ºC durante 24 h.  Los cultivos se defloculan con EDTA y se resuspenden al 2% (p/v) en tampón acetato pH 4,5 adicionado de 3 mM CaCl2. Las suspensiones celulares se tratan BSA-Gal-FITC (sonda galactosa-específica), se incuban 10 min a temperatura ambiente y se mide la fluorescencia total (sonda fijada + sonda libre) y la fluorescencia del sobrenadante luego de centrifugar (sonda libre). La cantidad de sonda fijada se calcula por diferencia entre la cantidad de sonda total y libre. El número de sitios lectínicos por célula (Nºlec/cel) se estima aplicando la ecuación de Scatchard. Células de levaduras crecidas en medio YMPG20  fijan el 100% de la sonda fluorescente a 8 h de incubación en presencia de 5 y 10 µg de BSA-Gal-FITC. Cuando se adicionan 15 y 20 µg de sonda fluorescente, se observa un porcentaje máximo de fijación a 24 h de incubación (92% y 93%, respectivamente). Este porcentaje no se modifica a mayores tiempos de incubación, indicando que existe una cinética de saturación de  los receptores lectínicos que unen ligandos fluorescentes. Cuando K. apiculata se cultiva en medio YMPG2 se observa un menor porcentaje de fijación de la sonda fluorescente y la densidad de los receptores específicos disminuye 1,5 veces en relación a las células crecidas en YMPG20. Los ensayos de fluorescencia confirman la presencia de lectinas galactosa-específicas sobre la superficie de K. apiculata mc1 y que la inducción de la autofloculación por glucosa en esta levadura apiculada implica la síntesis de nuevos receptores lectínicos. El conocimiento de los mecanismos bioquímicos y regulatorios involucrados en la floculación de K. apiculata mc1 permite predecir el comportamiento de esta levadura durante la vinificación.