EFECTO DE PROTEASAS SOBRE LA COFLOCULACION DE LEVADURAS VINICAS

OSCAR ANTONIO SOSA; ESTELA NOEMI SANTILLAN; MARIA CRISTINA MANCA DE NADRA; MARTA ELENA FARÍAS

ARGENTINA

Congreso; XXIV JORNADAS CIENTÍFICAS DE LA ASOCIACIÓN DE BIOLOGÍA DE TUCUMÁN; 2007

La autofloculación es un fenómeno que expresan algunas cepas de levaduras y resulta de la agregación asexual de células individuales que conduce a la formación de asociaciones multicelulares estables. Este fenómeno tiene interés comercial en bebidas fermentadas, principalmente como un método económico para la separación de células del medio, al final del proceso de fermentación. La teoría lectínica postula que la floculación resulta de la interacción entre un receptor glicoproteico y un ligando glicosídico, localizados sobre la pared celular de las levaduras. Esta interacción célula-célula puede ser inhibida reversiblemente por carbohidratos, e irreversiblemente por proteinasas. En trabajos anteriores determinamos que Kloeckera apiculata mc1, levadura aislada de vino argentino presenta fenotipo autofloculante con interacción lectina-galactosa estabilizada por iones Ca2+. Demostramos que este microorganismo es capaz de agregar con una cepa no floculante de Saccharomyces cerevisiae, fenómeno conocido como cofloculación. El objetivo de este trabajo es determinar el efecto de enzimas proteolíticas sobre la cofloculación K. apiculata mc1/S. cerevisiae mc2, con el propósito de caracterizar el modelo de interacción célula-célula entre ambas levaduras. Los microorganismos se cultivan en medio YMPG (extracto de levadura, 10 g/l; extracto de malta 5 g/l; peptona, 20 g/l l; glucosa, 20 g/l pH 5,5), a 28°C. Los cultivos mixtos se inoculan en relación 1:2 de K. apiculata y S. cerevisae, respectivamente. Las células totales se determinan en medio malta agar (MEA). En cultivo mixto, K. apiculata se enumera diferencialmente en medio MEA adicionado con 1 μg/ml cicloheximida, ya que bajo estas condiciones S. cerevisiae no desarrolla. A 18 h de incubación los cultivos se centrifugan, se lavan con tampón fosfato pH= 7 (PBS) y se resuspenden en tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,5 (control) o adicionado de 1 mg/ml de tripsina, quimotripsina o proteinasa K. Las suspensiones celulares se incuban 2 h a 28ºC, se lavan con PBS, y se resuspenden en tampón refloculante. El porcentaje de floculación se determina sometiendo a las células floculadas a una agitación vigorosa. Se deja reposar 10 minutos y se mide el número de células viables a partir de una alícuota del sobrenadante obtenida inmediatamente por debajo del menisco del medio liquido (células libres). El resto del cultivo se dispersa con tampón EDTA-Na3PO4, 50 mM pH 7,5 y se determina el número de células viables totales. % floculación = [(ufc/ml totales – ufc/ml libres)/ ufc/ml totales] x100. La superficie de las células que interactúan se observa por microscopía electrónica de barrido. Cuando las suspensiones celulares obtenidas a partir de cultivos puros y mixtos de ambas levaduras se tratan con las enzimas proteolíticas no se observa modificación de la viabilidad celular. La levadura apiculada revierte completamente su fenotipo autofloculante por el tratamiento con proteinasa K y quimotripsina después de 2 h de incubación. Tripsina presenta un efecto más gradual. Resultados similares se obtienen después de preincubar las células cofloculantes con proteinasas. La microscopía electrónica de barrido muestra que el tratamiento enzimático produce la desaparición de un mucus homogéneo presente en la superficie celular de las células cofloculantes. Los resultados nos permiten caracterizar parcialmente la cofloculación entre ambas cepas de levaduras, indicando que sobre la superficie de la pared celular de las levaduras que interactúan se ubican proteínas involucradas en el proceso de cofloculación.