Empleo de una nueva herramienta fotoquímica en el estudio de superficies de interacción entre proteínas.

GÓMEZ G.E; CAUERHFF A; CRAIG P.O; URETA D.B.; GOLDBAUM F.A; DELFINO J.M

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2002

La habilidad de las proteínas para formar complejos específicos y estables con otras proteínas es fundamental en muchos procesos biológicos. Comprender las bases moleculares del reconocimiento proteína-proteína requiere la caracterización detallada de las superficies en contacto. Métodos ampliamente empleados en la determinación de la estructura de macromoléculas como la cristalografía de rayos X (CRX) y la resonancia magnética nuclear (RMN) en solución tienen importantes limitaciones: el requerimiento de cristales, en el primer caso y la necesidad de contar con una solución suficientemente concentrada del complejo o el tamaño molecular máximo analizable, en el segundo caso. Por otro lado, en el estudio de los aspectos estructurales y funcionales de diversas proteínas se utilizaron sondas fotoquímicas como reactivos para marcación por afinidad, pero aquí debe disponerse del conocimiento previo de los residuos involucrados en la interacción para dirigir específicamente el reactivo, obteniéndose información restringida a regiones limitadas de la interfaz. Nuestro trabajo se basa en el empleo de diazirina (DZN), un gas fotorreactivo de tamaño y forma similar al agua o al nitrógeno, para el estudio de las superficies de contacto en complejos proteicos. La 3H-DZN, por irradiación a l >300nm, genera 3H-metileno (3HHC:), que reacciona instantánea e inespecíficamente con su celda molecular inmediata rindiendo productos 3H-metilados. Este reactivo ha sido utilizado exitosamente en nuestro laboratorio en el estudio de la estructura y plegamiento de proteínas solubles en agua como la a-lactalbúmina bovina  y la b-lactamasa de B.licheniformis. Aquí se usó 3H-DZN para la marcación del complejo IgG1D1.3-HEL (hen egg white lysozyme)       -empleado como modelo de interacción entre proteínas- dada la disponibilidad de las estructuras cristalográficas de HEL libre y complejada con los fragmentos FvD1.3 y FabD1.3 obtenidas a alta resolución (PDB code: 1vfb, 1fdl). HEL fue marcada libre o formando parte del complejo IgG1D1.3-HEL, incorporando 2.76 y 2.32 mmoles CH2 /mol proteína (a 1mM DZN),  respectivamente. El decremento de 15% en la marcación es consistente con la exclusión del área accesible al solvente asociada a la unión (11%), resultado esperable para la reacción inespecífica del carbeno con la cadena polipeptídica. Por otra parte, la digestión tríptica de HEL marcada y la posterior separación de los péptidos resultantes por tamaño molecular permitió medir el grado de la modificación en diferentes regiones de la proteína. Se observó una mayor incorporación de marca para HEL libre (8 a 25 % de marcación diferencial) en zonas del cromatograma correspondientes a la elución de péptidos de tamaño compatible con aquellos comprometidos en la unión. Analizando los resultados obtenidos a la luz del conocimiento proporcionado por otras técnicas estructurales, la modificación fotoquímica de complejos proteicos (“finger printing”) se perfila como una nueva metodología útil para la identificación y caracterización de superficies de contacto.