Medición de actividad de trans-sialidasa por un método no radioactivo

SARTOR, P; AGUSTI, R; LEGUIZAMON, MS; CAMPETELLA, O; MUCHNIK DE LEDERKREMER, R

Rosario, Santa Fe

Congreso; VIII Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2008

Sociedad Argentina de Parasitología

La trans-sialidasa (TS) es un factor de virulencia de T. cruzi que transfiere ácido siálico (AS) desde macromoléculas del huésped a la superficie del parásito. El método empleado para medir la actividad de TS involucra el uso de material radiactivo.  Se ha empleado la galactosa oxidasa (GO) en la detección de neuraminidasa de H. influenza en muestras biológicas, por la desialidación de galactosas. El método de GO se basa en la oxidación del C6 de glucosa generando H2O2 que en presencia de peroxidasa reacciona estequeométricamente con un sustrato colorimetrico/fluorométrico (Amplex Red, Invitrogen). Hemos adaptado el método de GO para detectar actividad de TS empleando, cómo dador de AS fetuina y como aceptor el disacárido D-Fuc(β1®6)GlcNAc OBn (DS1), por nosotros sintetizado. La actividad de TS se mide por remoción de AS exponeniendo galactosas que serán detectadas por el método de GO. DS1 fue sintetizado por 6-O glicosilación de bencil a-D-GlcNAc con tetra-O-benzoil-D-fucosa empleando SnCl4 como promotor. Luego de la desbenzoilación y purificación, DS1 fue caracterizado empleando espectroscopía 1H y 13C-NMR. Las propiedades del DS1 como aceptor fueron evaluadas empleando TS recombinante y sialil-lactosa como dador y las mezclas de reacción fueron analizadas por HPAEC-PAD. Realizamos ensayos de competencia de aceptores, empleando lactosa radiactiva (convencional) y DS1, ambos mostraron eficiencia similar. La reacción de TS fue acoplada al método GO. La absorbancia resultó dependiente de la concentración de TS y del tiempo. La actividad disminuyó al preincubar TS con DANA o anticuerpos neutralizantes de TS. El método presentado permite determinar transferencia de AS en tiempo real siguiendo el desarrollo de color/fluorescencia.