Relación estructura/función en los sensores de beta-lactámicos en Staphylococcus aureus

FABBRI, CAROLINA; LLARRULL, LETICIA I.

Rosario

Jornada; Primeras Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF, UNR; 2021

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR)

Introducción:Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA, por las siglas en inglés) es unimportante patógeno virtualmente resistente a todo tipo de antibióticos b-lactámicos. Estaresistencia se debe a la producción de la serin-β-lactamasa PC1, pero mayormente a laadquisición de un gen (mecA) que codifica una transpeptidasa accesoria, PBP2a, que tienebaja afinidad por la mayoría de los b-lactámicos. El gen mecA forma parte de un operónque permite la expresión inducible de la resistencia y está regulado mediante un represortranscripcional (MecI), un anti-represor (MecR2) y por la proteína sensora/transductoraMecR1, que detecta el antibiótico del medio y desencadena una serie de eventos queculminan con la manifestación de resistencia. La comprensión del mecanismo detransducción de señal por parte de MecR1 es de sumo interés dado que es un posibleblanco para el diseño de inhibidores para el tratamiento de infecciones debidas a MRSA.Resultados:Con el fin de obtener información estructural intentamos mapear interaccionesintramoleculares utilizando una técnica de foto-crosslinking. Generamos mutantes capacesde incorporar el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina (pAzF), conteniendo un grupoazida que al ser irradiado con luz UV genera un nitreno que reacciona con moléculascercanas espacialmente. Pudimos obtener proteínas recombinantes en membranas de E.coli BL21 StarTM(DE3) y se purificaron por afinidad utilizando una resina de níquel luego dela solubilización con el detergente caotrópico lauroil sarcosinato de sodio. Las muestrasresultantes se resolvieron por SDS-PAGE y se escindieron las bandas de interés del gelpara una posterior digestión con tripsina seguida de ESI-MS/MS. Los resultados arrojadospor la técnica de espectrometría de masa fueron alentadores, debido a que se obtuvo buenacobertura de secuencia y se logró evidenciar la correcta incorporación del pAzF.Actualmente estamos realizando la búsqueda de posibles interacciones con otros péptidosque nos permitan evidenciar interacciones intramoleculares.Por otra parte, contamos con una estrategia para evaluar los eventos molecularesfuncionalmente. Con este objetivo, nos encontramos desarrollando una cepa reportera enS. aureus RN4220 del sistema mec, en la cual la expresión del gen reportero gfp, quecodifica para la proteína verde fluorescente (GFP), queda bajo control del promotor del genmecA. Empleando esta cepa proyectamos monitorear cambios en la activación del sistemaluego de realizar mutagénesis sitio-dirigida en aminoácidos específicos de MecR1principalmente en regiones que se creen esenciales para el correcto funcionamiento de laproteína.Conclusiones:Obtuvimos las mutantes de interés capaces de incorporar el pAzF, algunas de las cualesfueron purificadas y sometidas a ESI-MS/MS.Nos encontramos en la construcción de una cepa reportera funcional para el sistema mec.