Dilucidando el mecanismo de activación del sistema VraSRT DE Staphylococcus aureus por antibioticos beta-lactamicos usando compuestos fotoactivables

ANTINORI, MELISA; MÉNDEZ, LUCIANA; SUAREZ, IRINA; TESTERO, SEBASTIÁN A.; LLARRULL, LETICIA IRENE

Rosario

Jornada; Primeras Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF, UNR; 2021

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR)

Introducción:Staphylococcus aureus es la principal causa de infecciones intra- y extra-hospitalarias. El sistema de tres componentes VraSRT presente en este patógeno detecta rápidamente el daño en la pared celular y coordina una respuesta que conduce a una susceptibilidad reducida a los antibióticos b-lactámicos y glucopéptidos. VraS es una histidina-quinasa de membrana, VraR un regulador de respuesta citoplasmático y VraT otra proteína de membrana esencial para la inducción del sistema VraSRT. Se desconoce el rol de VraT en el mecanismo de activación del sistema, así como la señal que éste detecta.Resultados:Se estudió la interacción entre VraS, VraT y diferentes fotosondas de afinidad derivadas de ampicilina. Primero, utilizando una cepa reportera de S. aureus, que contiene un vector donde la expresión de GFP está bajo el control de la región operadora del sistema VraSRT, confirmamos que estas fotosondas activan eficazmente al sistema en estudio. Luego, esferoplastos de E. coli BL21 Star DE3 sobre-expresando VraS o VraT se incubaron con dichas fotosondas para el marcado covalente de las proteínas. La interacción con VraS se evidenció por un cambio en la movilidad electroforética de la proteína, no así para el caso de VraT. Sin embargo, el análisis MALDI-TOF/TOF de los complejos de VraS-fotosonda purificados no permitió identificar el sitio de unión covalente. Evaluando la actividad autoquinasa de VraS, se detectó una mayor incorporación de fósforo radioactivo cuando la proteína es pre-incubada con la fotosonda derivada de ampicilina y luego irradiada para activarla.Bajo la hipótesis de que los antibióticos β-lactámicos podrían interactuar con el bucle extracelular de VraS, un péptido no detectado por MALDI-TOF/TOF, se introdujeron residuos de fenilalanina fotoactivos en la región de interés para el marcado con la penicilina fluorescente Bocillin-FL. No se logró detectar el aducto VraS fluorescente, lo que indicaría que no existe interacción directa del antibiótico con las posiciones 35 y 39 del bucle extracelular. El análisis de muestras de VraS teñidas negativamente y analizadas mediante la técnica de microscopía electrónica sugiere que formaría trímeros o tetrámeros. Mediante un ensayo de susceptibilidad a Proteinasa K de VraT en esferoplastos de E. coli observamos que su extremo C-terminal tiene localización periplasmática/extracelular.Conclusiones:Obtuvimos evidencia de la unión de derivados de b-lactámicos a VraS pero no fue posible identificar la región de VraS con la cual interactúan. La actividad autoquinasa de la misma se incrementa ante la incubación con la fotosonda derivada de ampicilina activada. Asimismo, la proteína parece estar formando trímeros o tetrámeros. Además, VraT posee un extremo C-terminal extracelular y si bien participa en la activación del sistema, su función no sería como un receptor de b-lactámicos.