La metalo-beta-lactamasa de Bacillus cereus usa un mecanismo ramificado para hidrolizar diferentes antiobióticos

TIONI, M.F.; LLARRULL, L.I.; VILA, A.J.

Villa Carlos Paz, Córdoba

Congreso; XXXIV Reunión Anual Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Las metalo-beta-lactamasas (MBLs) son enzimas dependientes de Zn(II) que hidrolizan a los antibióticos beta-lactámicos inactivándolos. Estas enzimas poseen una gran actividad hidrolítica contra la mayor parte de los antibióticos beta-lactámicos de uso clínico y hasta el presente, no se han desarrollado inhibidores aptos para el uso en la terapéutica. El diseño racional de nuevas drogas para combatir la resistencia a antibióticos beta-lactámicos causada por MBLs, está condicionado al conocimiento detallado del mecanismo catalítico de estas enzimas. La MBL de Bacillus cereus(BcII) ha sido caracterizada en profundidad tanto desde un punto de vista estructural como bioquímico. Sin embargo, el requerimiento de metal de BcII sigue siendo un punto de controversia. Algunas evidencias apuntan a que la enzima une un equivalente de ion metálico [Carfi A. et al.(1995) EMBO J. 14: 4914-4921; de Seny D. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 45065-45078], en tanto que otras sugieren que la especie mayoritaria es dinuclear [Orellano E. et al. (1998) Biochemistry 37: 10173-10180; Fabiane S.M .et al. (1998) Biochemistry 37: 12404-12411]. En este trabajo, empleamos técnicas de cinética rápida para estudiar la reacción de BcII con tres sustratos diferentes: bencilpenicilina (BP), cefotaxima (CTX) e imipenem (IMI). Para tal fin, la enzima fue sustituida con Co(II), ya que este metal ha demostrado ser una excelente sonda espectroscócpica del Zn(II). La enzima sustituida con Co(II) exhibe un espectro electrónico característico con bandas asociadas a cada sitio de unión a metal, lo que permite monitorear independientemente los eventos que ocurren en el entorno de coordinación de cada ion Co(II) unido. Con un sistema de flujo detenido combinado con un arreglo de diodos, seguimos la hidrólisis de IMI, CTX y BP con BcII. Estos datos fueron usados para derivar mecanismos cinéticos mínimos para cada caso. Encontramos que ninguna de las reacciones en estudio podía ajustarse a un mecanismo lineal. El grado de complejidad del mecanismo catalítico mínimo necesario para acomodar los resultados, varía según el sustrato, pero en todos los casos, fue necesario introducir una ramificación. Analizamos la reacción de la enzima sustituida con diferentes cantidades de Co(II) y, si bien la velocidad de reacción se vio afectada, en todos los casos obtuvimos espectros idénticos para las especies intermediarias. Esto sugiere que la especie catalítica involucrada en la reacción sería la misma, independientemente de la relación molar enzima/Co(II). Además, los dos sitios de unión a metal, sufren cambios en su geometría, que exhiben una evolución sincronizada. Es decir, que ajustan independientemente al mismo mecanismo y arrojan las mismas constantes cinéticas. Conjuntamente, estas evidencias nos condujeron a la conclusión de que la especie catalítica principal (si no la única) es la forma es la forma dinuclear de BcII.