Estudio de la vía endocítica del virus Junin en células Vero

MARTINEZ GUADALUPE, CORDO SANDRA Y CANDURRA NÉLIDA

Buenos Aires, Argentina

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

Los pasos iniciales de una infección viral involucran la unión específica de un virus a su receptor, ubicado en la superficie celular, seguida por su internalización en la célula y posterior desnudamiento. Hasta el momento, fueron caracterizadas dos vías de entrada mediadas por receptor: la endocitosis mediada por vesículas recubiertas con clatrina y la endocitosis mediada por caveolas. El virus Junín se adsorbe a las células por unión a un receptor, hasta el momento no descripto, y posterior endocitosis, por una vía aun no caracterizada, dependiente del pH. En este trabajo se utilizaron los compuestos sacarosa (Sac) y clorpromacina (CZ) que inhiben la formación de las vesículas recubiertas con clatrina y compuestos que actúan desestabilizando los microdominios de membrana (“lipid-raft) para impedir la internalización por la vía de caveolas: nistatina (NT), Metil-b-ciclodextrina (MbCD) o hidroxiderivados del colesterol en concentraciones no citotóxicas. Se ensayó la actividad virucida de los mismos, encontrando un porcentaje de reducción de la infectividad mayor a 90 al pretratar al virus con NT o MbCD. La expresión de la nucleoproteína (NP) se evaluó en cultivos pretratados con los compuestos, luego infectados en presencia de los mismos, en el caso de no poseer actividad virucida (CZ y Sac), o en ausencia para los que presentan actividad virucida (NT y MbCD). Luego de la infección se incubaron los cultivos durante 48 hs. en presencia de suero inmune, se fijaron los cultivos y se incubaron con anticuerpos monoclonales contra la NP para su análisis por Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Se encontró una disminución significativa en el número de células marcadas para NP en los tratamientos con CZ y Sac. Se estudió, por fluorescencia directa, el comportamiento de transferrina, que penetra en la célula por endocitosis dependiente de vesículas recubiertas con clatrina, y toxina colérica, que es endocitada en forma dependiente de caveolas. En las condiciones utilizadas para estudiar la entrada del JUNV, la endocitosis de la transferrina es inhibida por CZ y Sac, mientras que la entrada de la toxina colérica es inhibida por NT y MbCD. Al analizar los cultivos por Western-blot, se observó que la síntesis de la NP se encontraba significativamente disminuída en los cultivos pretratados con CZ y Sac. Varias vías de entrada se realizan con la participación del citoesqueleto, por lo que estudiamos el efecto de compuestos que alteran específicamente distintos componentes del citoesqueleto sobre la entrada del JUNV a las células Vero. Se pretrataron los cultivos con nocodazol, compuesto que despolimeriza los microtúbulos, o con DMSO, compuesto que altera los microfilamentos de actina,  luego se infectaron con JUNV y se incubaron durante 48 hs en presencia de suero neutralizante. Al cabo de este tiempo se fijaron e incubaron con anticuerpos contra la NP para analizar la expresión de la NP por IFI. Los resultados obtenidos indicaron una marcada disminución de la expresión de la NP en los cultivos pretratados con DMSO, mientras que la reducción no fue significativa para los cultivos pretratados con nocodazol. Simultáneamente se observó la efectividad del tratamiento con DMSO y nocodazol, por fluorescencia, utilizando anticuerpos monoclonales anti-tubulina y Faloidina-FITC. Estos resultados sugieren que el JUNV utiliza preferentemente el camino endocítico mediado por vesículas recubiertas por clatrina en células Vero. Además, sería necesaria la integridad de los microfilamentos de actina, para la infección exitosa del JUNV en células Vero. Los resultados obtenidos en  éste trabajo representan un aporte importante para la identificación de la molécula de membrana que actúa como receptor del JUNV.