EFECTO DEL DESPLEGAMIENTO DE BETA-GAL INDUCIDO POR LUZ ULTRAVIOLETA SOBRE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y SU INTERACCIÓN CON BICAPAS DE FOSFOLÍPIDOS

SANCHEZ, JM Y PERILLO, MA

Carlos Paz. Cordoba. Argentina

Otro; XXXII Reunion anual de la SAB; 2005

SAB

En trabajos previos demostramos que la b-galactosidasa de E. coli (b-Gal), una enzima soluble, es capaz de asociarse a membranas modelo. Esta interacción puede modular la estructura y la actividad de b-Gal de manera dependiente de las características topológicas de las interfases (curvatura, grado de empaquetamiento, etc) (1,2) e incrementar la resistencia a la inactivación de la enzima inducida por temperatura o pH (3). El valor del coeficiente de partición membrana/agua de b-Gal  fue 118 (Log PMLV/agua= 2.07) (4). Estas membranas consistieron en vesículas multilamelares (MLVs) de fosfatidilcolina de soja, de un diámetro promedio de 1000 nm. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la estabilidad de b-Gal frente a un agente desnaturalizante en presencia de membranas de alta curvatura. Como modelo de membrana se utilizaron vesículas unilamelares grandes (LUVs). El análisis turbidimétrico mostró que estos  liposomas poseían un diámetro significativamente menor, y en consecuencia presentaban interfases de mayor curvatura, que las MLVs. Como agente desnaturalizante se aplicó la irradiación con luz UV proveniente de una lámpara de Hg de baja presión (longitud de onda de máxima emisión 254 nm), durante 30 min. a 4oC. La enzima se incubó durante 15 min a temperatura ambiente, en ausencia o en presencia de LUVs, a una relación molar lípido/proteína 1.82 x 1010. Posteriormente, se procedió a la irradiación de las muestras en las condiciones indicadas. En las muestras de b-Gal irradiada o no irradiada se determinaron: a) la actividad enzimática en presencia y o en ausencia de LUVs (ver refs.en 1) y b) el coeficiente de partición, Pa/LUVs según ref.5, para lo cual se midió la fluorescencia intrínseca (FI) de b-Gal en un rango de concentraciones entre 0.038 a 0.2 g/l para distintas concentraciones de PC (0.31-1 g/l). A diferencia de lo observado en presencia de MLVs, la actividad de b-Gal no fue afectada por la presencia de LUVs. Además la interacción b-Gal–LUVs no protegió a la enzima de la inactivación por la irradiación con luz UV. La irradiación indujo una disminución de un 38 % en la intensidad y un aumento en la lmax (desde 347 a 363 nm) de emisión de la fluorescencia intrínseca de b-Gal, respecto a lo observado con la enzima no irradiada. El coeficiente de partición LUVs/agua fue significativamente mayor al MLVs/agua para la enzima no irradiada y la irradiación indujo un aumento adicional (Log PLUVs/agua=4.67 para la enzima irradiada y de Log PLUVs/agua= 5.13 para la enzima no irradiada). Estos resultados indican que la irradiación indujo un cambio conformacional que llevó a una exposición de ciertos residuos triptofano a ambientes de mayor polaridad, compatible con un desplegamiento de la estructura de la proteína. Esto indujo la pérdida de la actividad enzimática y un aumento en su tendencia de la proteína a particionarse en la interfase lípido-agua favorecida entrópicamente por la deshidratación de las superficies interactuantes (lípido y proteína). De acuerdo a nuestros resultados previos, teniendo en cuenta la mayor curvatura de los LUVs, se espera una interacción más íntima entre la enzima y LUVs comparado con lo que ocurre con MLVs  (es decir que la penetración prevalezca sobre la  adsorción de la enzima a la interfase). La incapacidad de los LUVs para proteger la actividad de b-Gal frente al agente desnaturalizante sería consecuencia de la exposición de zonas de la proteína fundamentales para la catálisis, al interactuar con LUVs. La ausencia de superactividad en la b-Gal en presencia de LUVs podría reflejar un impedimento del sustrato para difundir en la interfase (1,2), la ausencia del mecanismo modulatorio de tipo nucleofílico que se manifiesta en interfases de baja curvatura (1,2), o a una compensación entre estos dos fenómenos. 1- Sanchez, JM., Perillo, MA. (2002a), Coll Surf.24, 21. 2- Sánchez,JM., Perillo, MA. (2002b),Biophys.Chem.99, 281 3- Sanchez, JM and Perillo, MA (2004). Medicina,64, 232 4- Sánchez, J.M.et al. (2005) Biophys. Chem. (en prensa) 5- Lissi et al.  (1990) Biochim. Biophys. Acta 1021, 46.