Generación de un biblioteca de fragmentos VHH de Llama específico para gliadinas y estables en medios desnaturalizantes

BAYARDO M,; URRUTIA M,; DOÑA V,; ALZOGARAY V,; CARLOS ALBERTO FOSSATI; F G, GOLDBAUM; CHIRDO FG,

Mar del Plata

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas; 2004

La enfermedad celíaca es una intolerancia permanente a proteínas de trigo, cebada, centeno y avena. Para su tratamiento, los pacientes deben seguir una dieta estricta libre de las proteínas nocivas consumiendo alimentos analizados por un ELISA cuantitativo. Sin embargo, la baja eficiencia de extracción de las proteínas del alimento es una seria dificultad técnica. Para mejorarla extracción se ha propuesto el uso de agentes reductores y desnaturalizantes, pero estos afectan el ensayo inmunoquímico. Sabiendo que los fragmentos VHH de anticuerpos de camélidos presentan una mayor estabilidad que los anticuerpos convencionales ,el objetivo de este trabajo fue la generación de una biblioteca de fragmentos VHH y la selección de clones tales que su reactividad inmunoquímica no se altere en condiciones desnaturalizantes. Llamas inmunizadas con gliadinas (proteínas de trigo) desarrollaron alto título de anticuerpos específicos. El cDNA aislado de linfocitos de sangre periférica se utilizó como templado para generar una biblioteca de fragmentos VHHs con alta diversidad, conteniendo 8x10(7) clones independientes. El panning y la selección de la biblioteca se realizó mediante la técnica de display en fagos. Ensayos de unión por ELISA nos permitieron aislar 33 clones con capacidad de unirse a gliadinas.La estabilidad fue evaluada por ELISA indirecto incubando los clones en presencia de etanol (Et), 2-mercaptoetanol (2ME), cloruro de guanidinio (G). Cinco clones fueron estables en Et 15%.Cuatro clones mostraron más de un 50% de reactividad en presencia de 0.5% 2ME y 0.5 mM G. En un ensayo cuantitativo tres clones produjeron una buena curva dosis respuesta. Se ha generado una biblioteca de fragmentos VHH de llama específicos de gliadinas. Los resultados preliminares indican que los fragmentos VHH constituyen un excelente sistema de reconocimiento de antígenos que puede emplearse en condiciones parcialmente desnaturalizantes.