Estudio de las propiedades de la membrana plasmática de celulas del parenquima de raíz de remolacha (Beta vulgaris).

KARINA ALLEVA; MOIRA SUTKA; RICARDO DORR; MARIO PARISI; GABRIELA AMODEO

Tafi del Valle Tucumán, Argentina

Congreso; XXV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica.; 2001

Sociedad Agentina de Biofisica

Estudios a nivel célula entera (protoplastos): se utilizó una técnica convencional de digestión enzimática y centrifugación para obtener una preparación limpia de protoplastos adaptando un protocolo de Schmidt y Poole [Plant Physiol. (1980) 66:25-28]. Resultados: se obtuvieron preparaciones con un rendimiento de 3.10 106 protoplastos.ml-1 y con diámetro promedio 32.21± 0.62 mm (± SEM, n=174) para un medio iso-osmótico (530 mOsm.kg-1). Utilizando un método por videomicroscopía que permite medir cambios volumétricos en células en tiempos muy cortos (segundos), y reduciendo además el intervalo de medición de un mismo protoplasto entre el control (iso-osmótico) y el sometido a gradiente osmótico se realizaron estimaciones de la permeabilidad al agua de los protoplastos aislados. El cambio de volumen relativo (V/Vo) a los 20s de haber impuesto un gradiente osmótico de 200 mOsm.kg-1 fue del 15% ± 1 (± SEM, n=7 aislamientos independientes, 4 a 7 protoplastos analizados por aislamiento). Debido a que en las condiciones experimentales no se puede descartar la presencia de una capa no mezclada transferida se calcularon los valores de permeabilidad considerando la presencia de la misma [Parisi y Piccinni, 1973, J. Memb. Biol. 12:227-234]. Estudios a nivel subcelular: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja.: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja. Conclusiones: En protoplastos aislados estimamos la permeabilidad al agua de la preparación bajo estudio. Se optimizó además una técnica de aislamiento de vesículas de membrana plasmática, altamente purificada que permitirá realizar estudios de transporte de agua y solutos a traves de la manipulación completa de las concentraciones a ambos lados de la membrana (lado interno y externo) y la utilización de la escalas temporales rápidas de medición a través de técnicas más sofisticadas (stopped flow). Estudios a nivel subcelular: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja.: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja. Conclusiones: En protoplastos aislados estimamos la permeabilidad al agua de la preparación bajo estudio. Se optimizó además una técnica de aislamiento de vesículas de membrana plasmática, altamente purificada que permitirá realizar estudios de transporte de agua y solutos a traves de la manipulación completa de las concentraciones a ambos lados de la membrana (lado interno y externo) y la utilización de la escalas temporales rápidas de medición a través de técnicas más sofisticadas (stopped flow). (protoplastos): se utilizó una técnica convencional de digestión enzimática y centrifugación para obtener una preparación limpia de protoplastos adaptando un protocolo de Schmidt y Poole [Plant Physiol. (1980) 66:25-28]. Resultados: se obtuvieron preparaciones con un rendimiento de 3.10 106 protoplastos.ml-1 y con diámetro promedio 32.21± 0.62 mm (± SEM, n=174) para un medio iso-osmótico (530 mOsm.kg-1). Utilizando un método por videomicroscopía que permite medir cambios volumétricos en células en tiempos muy cortos (segundos), y reduciendo además el intervalo de medición de un mismo protoplasto entre el control (iso-osmótico) y el sometido a gradiente osmótico se realizaron estimaciones de la permeabilidad al agua de los protoplastos aislados. El cambio de volumen relativo (V/Vo) a los 20s de haber impuesto un gradiente osmótico de 200 mOsm.kg-1 fue del 15% ± 1 (± SEM, n=7 aislamientos independientes, 4 a 7 protoplastos analizados por aislamiento). Debido a que en las condiciones experimentales no se puede descartar la presencia de una capa no mezclada transferida se calcularon los valores de permeabilidad considerando la presencia de la misma [Parisi y Piccinni, 1973, J. Memb. Biol. 12:227-234]. Estudios a nivel subcelular: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja.: Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condición nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener una fracción purificada de vesículas de membrana plasmática. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60± 0.15 mg proteina.g-1 de tejido fresco, ± SEM, n = 6 aislamientos independientes). A partir de la misma se realizó la purificación de la fracción correspondiente al plasmalema para lo cual se utilizó el sistema de partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol) que ha demostrado ser más efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificación se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmáticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplásticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron así dos muestras de membrana plasmática que se denominaron PM1 y PM2 respectivamente, siendo PM1 la primer fase superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon dichas actividades con las presentes en la fracción microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaría comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Estos factores son acordes con los informados en la literatura clásica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55± 0.55 m moles.min-1.mg1-proteina, n=5 ), retículo endoplasmático (0.28± 0.09 m moles.min-1.mg-1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29± 0.63 m moles Pi.h-1mg-1 proteina, n=7), indican que la contaminación por parte de éstas en las fracciones purificadas es muy baja. Conclusiones: En protoplastos aislados estimamos la permeabilidad al agua de la preparación bajo estudio. Se optimizó además una técnica de aislamiento de vesículas de membrana plasmática, altamente purificada que permitirá realizar estudios de transporte de agua y solutos a traves de la manipulación completa de las concentraciones a ambos lados de la membrana (lado interno y externo) y la utilización de la escalas temporales rápidas de medición a través de técnicas más sofisticadas (stopped flow).