La desnaturalización térmica en el control de calidad de proteínas terapéuticas.

BALLATORE, M; CARLUCCI, A; DELFINO J.M.; CURTO L.M.

Congreso; 11° Congreso y Exposición para la Ciencia y Tecnología Farmacéutica, Biotecnológica y Veterinaria.; 2022

Introducción: Los productos basados en proteínas imponen grandes desafíos, entre ellos el diseño de formulaciones que mantengan la estabilidad física y química en las condiciones de almacenamiento. Aquí presentamos un sistema modelo simple en el cual estimamos la estabilidad térmica de una proteína, monitoreando su estructura secundaria por dicroísmo circular (CD), en presencia o ausencia de agentes con documentado impacto sobre la conformación. Este modelo nos permite evaluar el riesgo de un análisis sobre-simplificado/incompleto de la estabilidad. Metodología: Como modelo usamos IFABP (14 kDa), una proteína carente de puentes disulfuro, con estructura secundaria beta y disuelta en buffer fosfatos de sodio 20mM, 150mM NaCl, pH 8.0. Para modificar la estabilidad, usamos compuestos ampliamente estudiados por la comunidad científica: el desnaturalizante cloruro de guanidinio, (1.25M GdmCl) y el osmolito estabilizador N-óxido de trimetilamina (0.75M TMAO).El desafío conformacional es térmico. Tal como es habitual, se evaluará el cambio en la señal dicroica a longitud de onda fija en función de la temperatura. Ventajosamente, el espectropolarímetro Chirascan-V100 (Applied Photophysics) nos permite colectar a lo largo de la rampa de calentamiento, espectros de CD, de absorción y el voltaje emulado. Tanto en el ámbito científico como en control de calidad, la estabilidad estructural suele estimarse a través del Tm. Este parámetro corresponde a la temperatura media de la transición conformacional disparada por la temperatura. Suele graficarse la evolución de la señal dicroica a una cierta longitud de onda en función de la temperatura y luego, tras ajustarse una ecuación a los datos, se obtiene dicho parámetro. No conocer el mecanismo de plegado de la proteína bajo análisis o, simplemente ignorar si éste es o no reversible, puede llevar a la elección de un incorrecto modelo de ajuste. Resultados:Si únicamente analizamos la evolución de la máxima señal a una longitud de onda fija y suponemos reversibilidad, obtenemos valores de Tm que nos permiten “confirmar” que los aditivos ejercen el efecto esperado. Sin embargo, una ampliación del análisis revela un panorama más complejo. La comparación de los espectros iniciales (a temperatura ambiente) muestra que los aditivos no modifican masivamente la estructura secundaria, mientras que los espectros a alta temperatura indican que los estados finales de las transiciones no resultan comparables. La reversibilidad del fenómeno puede evaluarse contrastando el espectro inicial con aquél obtenido tras el enfriamiento de la muestra.La simple inspección visual de las cubetas evidencia la presencia de agregados. Monitorear la evolución del voltaje (o absorción) con la temperatura permite detectar cambios en la turbidez, signo indicativo de agregación. Así podemos obtener el valor de Ton, la temperatura a la que se inicia la desnaturalización/agregación. Este nuevo escenario confirma el efecto deletéreo del GdmCl sobre la estabilidad, al tiempo que no se manifiesta el carácter estabilizador del TMAO, sino que este agente promueve la agregación. Conclusiones: Con practicidad, estandarización y con equipamiento de avanzada complementado con un análisis permite extraer información valiosa a partir de experimentos simples.