Diseño de ligandos peptídicos para la purificación de hormona de crecimiento humana recombinante a partir de leche bovina

SOLEDAD L. SAAVEDRA; MARIA C MARTINEZ CERON; SILVANA L. GIUDICESSI; OSVALDO CASCONE; SILVIA A. CAMPERI

Congreso; ETIF 2016: 9º Congreso y Exposición para producción farmacéutica, biotecnológica y veterinaria; 2016

La hormona de crecimiento humana (hGH) es una proteína que actúa estimulando el crecimiento y la reproducción y regeneración celular [1]. Desde mediados del siglo XX se la usa para el tratamiento del hipopituitarismo y de otros fenómenos relacionados y, previo al advenimiento de la tecnología recombinante, se purificaba a partir de la hipófisis de cadáveres, lo que tuvo como consecuencia varios casos de la enfermedad de Creutzfeld?Jacob (mal de la vaca loca) [2, 3].Gracias a la sencillez y al conocimiento sobre el mismo, y debido a la falta de modificaciones post-traduccionales de la proteína, el organismo elegido en la actualidad para la producción de hormona recombinante (rhGH) a nivel industrial es Escherichia coli. Sin embargo, el alto nivel de expresión proteico obtenido hace que la hormona forme mayoritariamente cuerpos de inclusión, complicando su purificación debido a la presencia de algunos contami-nantes, entre ellos moléculas inactivas del producto de interés [2, 4].Existen otros sistemas de expresión heterólogos de la hormona, y entre ellos se encuentra la producción en leche de vaca transgénica. Se han reportado valores de hasta 5 g/l de rhGH provenientes de la leche de un único animal, por lo que se estima que manteniendo el mismo ritmo de producción, y una vez que los bovinos alcancen su madu-rez, se podría cubrir el requerimiento de hormona a nivel mundial con sólo 15 vacas [5]. Sin embargo, la leche es una fuente rica en proteínas, por lo que la purificación del producto de interés puede requerir varios pasos de purifi-cación [6], disminuyendo el rendimiento y aumentando el costo del proceso.Los procesos cromatográficos por afinidad permiten una reducción del número de pasos de purificación al introducir una interacción específica entre el ligando y el producto de interés. Dentro de la variedad de ligandos con afinidad disponibles, los péptidos cortos presentan la ventaja de ser estables y resistentes a la acción de proteasas, pueden sintetizarse a bajo costo, en gran cantidad, y bajo normas GMP, y su interacción es lo suficientemente moderada como para poder eluirla proteína de interés en condiciones suaves [7].Con el objetivo de purificar rhGH a partir de leche de vaca transgénica, se seleccionaron y analizaron distintos pépti-dos sintéticos con afinidad por la proteína.Se sintetizó una biblioteca combinatoria de péptidos en fase sólida mediante el método dividir-acoplar-recombinar, el cual permite que cada bolilla de polímero sintético repre-sente una única entidad peptídica. Se marcó con biotina rhGH gentilmente provista por ZELLTEK S.A. Una vez sinte-tizada la biblioteca, se sometió una porción de la misma a un screening con la rhGH marcada y se reveló mediante el sistema estreptavidina-peroxidasa con α-cloronaftol y H2O2.Las bolillas positivas para la interacción, visualizadas por su coloración violeta, fueron aisladas manualmente, lavadas y analizadas mediante espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF para determinar su secuencia peptídica. Una vez obtenidas varias secuencias, se realizó una comparación entre las mismas para determinar frecuencia de aparición de aminoácidos por posición en el péptido y la presencia de patrones.Se seleccionaron seis péptidos (G1-G6) y se volvieron a sintetizar en mayor cantidad para confirmar suafinidad por la rhGH. Sólo tres de los péptidos mostraron buena afinidad por la misma (G1, G4 y G6), por lo que se los sin-tetizó en mayor cantidad y se inmovilizaronen agarosa. Se ensayaron cromatografías con la hormona pura en distintas condiciones de adsorción y eluyendo con buffer acetato de sodio/ácido acético 100 mM pH 3.6, NaCl250 mM. Se observó que la mejor condición encontrada se obtuvo con G6 en buffer Tris/HCl 50 mM pH 9 y que permitió un 87% de adsorción.Nuestra metodología permitió encontrar un péptido con afinidad por la hormona de crecimiento recombinante. Se seguirá trabajando con el mismo péptido para seguir caracterizándolo (isotermas de adsorción, curvas de breakthrough) y se ensayarán cromatografías con la rhGH en leche para determinar la selectividad del mismo frente a una mezcla compleja.