Evaluación de la inmunorreactividad y conservacion de candidatos vacunales de Cryptosporidium parvum

TOMAZIC, MARIELA L; LOMBARDELLI, JOAQUÍN; POKLEPOVICH, TOMÁS; GALARZA, ROXANA; TOLEDO, JONATHAN; CARLOS GARRO; TIRANTI, KARINA; FLORIN-CHRISTENSEN, MÓNICA; SCHNITTGER, LEONHARD

San Salvador de Jujuy

Congreso; XXI Reunión Científico Técnico Dr Bernardo Jorge Carrillo: Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnóstico; 2016

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Introducción. La criptosporidiosis bovina es causada por el protozoo apicomplexa Cryptosporidium spp. y es una enfermedad desatendida a nivel global y local. Es una zoonosis y antroponosis que afecta a inmunosuprimidos y a niños menores de 3 años. A nivel local, se considera a los terneros como mayor reservorio para el parásito y por ende para su diseminación, ya que es el ooquiste, eliminado por las heces, el causante de las infecciones. Hasta hoy, estudios moleculares han identificado exclusivamente a la especie C. parvum en terneros de nuestro país, la cual es considerada la especie zoonótica mas importante [1]. En la actualidad solo existen medidas paliativas, no hay drogas ni vacunas que curen ni controlen la enfermedad [2].El desarrollo de una vacuna efectiva traería aparejados múltiples beneficios, no solo porque mejoraría la salud y el bienestar de los animales sino que permitiría controlar la zoonosis y los brotes causados por contaminación de aguas y alimentos con ooquistes, mejorando así la salud pública. La búsqueda de antígenos capaces de generar anticuerpos protectivos es esencial para el desarrollo de formulaciones vacunales. Los protozoos parásitos tienen abundantes proteínas asociadas a la superficie celular a través de un complejo glicolipídico denominado glicosilfosfatidilinositol (GPI), las cuales están implicadas en el proceso de invasión [3]. A partir de un estudio previo del proteoma de C. parvum con herramientas bioinformáticas, se identificó una lista de potenciales candidatos vacunales predichos de ser anclados por GPI [4]. El objetivo de este trabajo se centra en el estudio de la conservación de tres de estos antígenos y su capacidad de ser reconocidos por la respuesta humoral de terneros infectados naturalmente con C. parvum.Materiales y Métodos. Se usaron las siguientes herramientas bioinformáticas: (i) base de datos CryptoDB (expresión en los estadios infectivos), (ii) Blast reverso y OrthoMCL (búsqueda de ortólogos), (iii) Interpro y Pfam (identificación de dominios funciónales) y (iv) BCPRED y BEPIPRED, Kolaskar (predicción de epitopes B). El análisis de polimorfismo se realizó por amplificación por PCR seguido de secuenciación a partir de ADNg de 5 aislamientos de terneros naturalmente infectados. Los mismos provienen de tambos ubicados en las localidades de Santa Fe (subgenotipo: IIaA20G1R1), Córdoba (subgenotipo: IIaA21G1R1, IIaA23G1R1) y Buenos Aires (subgenotipos: IIaA17G1R1). Se expresó el marco abierto de lectura de los genes: cph1, cpgp60 y cpsubl. Se amplificaron a partir de aislamientos del subgenotipo IIaA23G1R1 de C. parvum encontrado hasta el presente exclusivamente en Argentina y fueron clonados en el vector pRSET con un tag de histidina. Se utilizó una cepa expresión de E. coli (Rosetta 2DE3 pLacI). Las proteínas recombinantes fueron purificadas por cromatografía de afinidad a iones metálicos (IMAC) y fueron utilizadas para ensayos de Western-Blot (WB). Se tomó sangre de 10 terneros a distintas edades y se obtuvieron 23 sueros en tres etapas: 1- 10 sueros de 1 a 11 días; 2- 10 sueros de 12 a 28 días; y 3- 3 sueros de 38 días y 52 días. Todos los terneros fueron previamente diagnosticados por microscopía óptica y posteriormente, de 3 de ellos, se identificó por PCR-RFLP a C. parvum como la especie infectante. Se determinó por refractometría si había falla de la transferencia pasiva de la inmunidad (FTPI).Resultados. Los antígenos seleccionados que fueron expresados en E. coli se denominaron: (i) Cph1r, (ii) Cpsublr y (iii) Cpgp60r, los cuales no presentan ortólogos en otros organismos, presentan epitopes B y se expresan en estadios infectivos. El análisis de polimorfismo para el gen cph1 mostró 100% de identidad entre los aislamientos, y en consecuencia los epitopes B predichos también son conservados. cpgp60 es un gen polimórfico, contiene una región hipervariable que es utilizada para subtipificación. Los epitopes B de esta proteína mostraron identidad entre los 5 aislamientos geográficos, a excepción de uno que se halla en la región hipervariable.El análisis de WB mostró que los 3 antígenos en estudio son inmundominantes, ya que fueron reconocidos por los sueros de los 10 terneros en estudio. Cpgp60r reaccionó con 6 sueros en la etapa 1 (1-11 días), con 9 sueros en la etapa 2 (12-28 días) y con los 3 sueros en la etapa 3. Cph1r fue reconocido por 5 sueros en la etapa 1, por 6 sueros en la etapa 2 y por los 3 sueros en la etapa 3. Cpsublr mostró reactividad con los 23 sueros en las tres etapas. Es de interés mencionar que no hubo diferencias en la inmunorreactividad con los 3 antígenos entre terneros con y sin FTPI.Discusión. Los resultados de inmunorreactividad obtenidos para Cpgp60r, sugieren que una prolongada infección aumenta considerablemente el número de individuos con seroconversión (negativos en la etapa 1 y positivos en las posteriores). Para Cph1r, se puede asumir que con un prolongado tiempo de infección no aumenta significativamente la seroconversión, dado que son positivos los sueros en todas las etapas a excepción de uno. Los resultados obtenidos para Cpsublr sugieren que es un antígeno altamente inmunodominante. No hubo diferencias entre terneros con y sin FTPI, lo cual podría indicar que no hay anticuerpos específicos y/o no son transferidos en el calostro. De todas formas, se requiere investigar esta hipótesis en más profundidad. En conjunto, estos resultados indican que las proteínas nativas generan una respuesta humoral en terneros infectados naturalmente. Esto, sumado a la ausencia de polimorfismos y conservación de epitopes B, sugieren que estas proteínas son atractivos candidatos vacunales y potenciales blancos terapéuticos.Bibliografía [1]M. L. Tomazic, J. Maidana, M. Dominguez, E. L. Uriarte, R. Galarza, C. Garro, M. Florin-Christensen, and L. Schnittger, ?Molecular characterization of Cryptosporidium isolates from calves in Argentina,? Vet. Parasitol., vol. 198, no. 3?4, pp. 382?386, 2013. [2]S. M. Cacciò and R. M. Chalmers, ?Human cryptosporidiosis in Europe,? Clin. Microbiol. Infect., 2016. [3]A. E. Rodriguez, M. Florin-Christensen, D. A. Flores, I. Echaide, C. E. Suarez, and L. Schnittger, ?The glycosylphosphatidylinositol-anchored protein repertoire of Babesia bovis and its significance for erythrocyte invasion,? Ticks Tick. Borne. Dis., vol. 5, no. 3, pp. 343?348, 2014.[4] ML Tomazic, AE Rodríguez, M Florin-Christensen and L. Scnhittger. ?Bioinformatic identification of vaccine and diagnostic candidates of Cryptosporidium parvum,? CONGRESS OF PARASITOLOGY. México 2014.Financiamiento: FonCyt: PICT-2013-1708; INTA: PNBIO-1131034 y PNSA-1115053; Fundación Universidad de Morón PID8-2015. PICT 0695-2012