IMPLEMENTACIÓN DE MICROSCOPÍA RAMAN EN EL ANÁLISIS DE LA ZONA PELÚCIDA DE OVOCITOS BOVINOS MADURADOS IN VITRO

RIZO, GABRIELA; ALVAREZ, RMS; GARCÍA, EV; BARRERA, AD; GARCÍA, DC; DORA C. MICELI; MARIELA ROLDÁN OLARTE

Buenos Aires

Jornada; IV Jornadas Internacionales del Instituto de Investigación y Tecnología de reproducción animal; 2014

INITRA

Los componentes del sistema proteolítico extracelular Plasminógeno (Plg)/Plasmina (Plm) están presentes en los gametos y el oviducto de mamíferos. En nuestro laboratorio, se localizó el Plg en la zona pelúcida (ZP) y membrana plasmática de ovocitos bovinos madurados in vitro (MIV) y se demostró que componentes de este sistema se expresan en los complejos cúmulo-ovocito (COCs). El Plg es enzimáticamente inactivo y al interactuar con sus activadores se convierte en Plm, involucrada en la proteólisis de la ZP. El objetivo de este trabajo fue estudiar si la generación de Plm durante la MIV de ovocitos bovinos produce modificaciones sobre las glicoproteínas de la ZP. Para ello, los COCs obtenidos mediante punción/aspiración de folículos, se seleccionaron y se maduraron in vitro en condiciones estándares, suplementado con estreptoquinasa (SK) 3,5 UI/ml (activador exógeno y específico del Plg) o con ácido e- amino caproico (ΕACA) 10 mM (inhibidor exógeno de Plm) durante 22 h en estufa gaseada con 5% de CO2 y 100% de humedad a 38,5 ºC. Luego de disgregar las células del cúmulo empleando hialuronidasa al 1%, los ovocitos se fijaron en formaldehído 4%. La ZP de los ovocitos de cada grupo experimental se analizó mediante microscopía Raman, empleando un microscopio Raman confocal con laser de 780 nm. Se realizaron 60 exposiciones de 5 segundos cada una en tres regiones al azar de la ZP y se registraron los espectros Raman generados. Para estudiar los cambios en la ZP inducidos por la generación o inhibición de Plm, se analizaron comparativamente los espectros obtenidos. Se observaron variaciones en la región espectral 1610-1670 cm-1, correspondiente a la banda Amida I. Según la bibliografía, la banda entre 1610 cm-1 y 1640 cm-1 caracteriza a la estructura secundaria hoja beta plegada, mientras que aquella encontrada entre 1650 cm-1 y 1660 cm-1, a la estructura α hélice. Los ovocitos que fueron MIV en presencia de SK, mostraron una banda α hélice más intensa con respecto al control. La SK, al activar el Plg de la ZP y generar Plm in situ, modificaría la estructura secundaria de las glicoproteínas que la forman alterando la relación α hélice/hoja beta. Esta modificación bioquímica durante la MIV, podría afectar positivamente la posterior fecundación in vitro de los ovocitos MIV en presencia de SK y el cultivo in vitro de los embriones obtenidos.