“Obtención de marcadores SCAR aplicables al estudio de la diversidad genética en poblaciones de vicuñas”

LONGO, A.E; GARCÍA, D.C; ROLDÁN-OLARTE, M; ROMERO, S; VALDECANTOS, P.A; MICELI, D. C

Tafi del Valle, Tucumán

Jornada; XXV Jornadas Científicas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2008

Asociación de Biología de Tucumán

El desarrollo de marcadores moleculares de ADN ha tenido un gran impacto en diferentes campos tales como evolución, genética de poblaciones, ecología, entre otros. Si bien existen diversas técnicas de biología molecular que pueden ser aplicadas a la obtención de nuevos marcadores, muchas de ellas requieren el conocimiento previo de secuencias de interés. Los marcadores moleculares RAPD (Amplificación al azar de ADN polimórfico) son muy útiles para estudiar genomas de especies de las cuales no se cuenta con suficiente información. Esta metodología se basa en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un solo cebador de secuencia arbitraria y condiciones poco restrictivas durante la reacción de amplificación. El cebador puede hibridar en diferentes regiones del genoma generando varios productos de amplificación, los cuales pueden estar o no presentes en muestras de diferentes individuos, permitiendo identificar polimorfismos. Debido a que aún se cuenta con escasa información genética de vicuñas, es útil contar con nuevas herramientas que permitan evaluar la diversidad genética en esta especie. En la actualidad la vicuña se encuentra protegida por convenios internacionales debido a la drástica disminución en el tamaño de sus poblaciones, lo que ha conducido a una reducción en la variabilidad genética. Los programas de conservación utilizan a menudo información acerca de la distribución de la variación genética para establecer prioridades y estrategias de manejo. Por este motivo, el objetivo de nuestro trabajo fue identificar nuevos marcadores moleculares que contribuyan al estudio de la diversidad genética de diferentes poblaciones de vicuñas que habitan en la puna argentina. Previamente se analizaron 31 cebadores mediante la técnica RAPD. Dos de los cebadores empleados (V03 y A10) se seleccionaron como marcadores RAPD en base a que generaron fragmentos polimórficos (presencia sólo en algunos individuos). Dado que mediante RAPD se generan muchas bandas de amplificación, en este trabajo se propuso convertir dichos marcadores en Regiones Caracterizadas por su secuencia (marcadores SCAR). Estos marcadores presentan la ventaja de que aumentan significativamente la reproducibilidad, facilitan la interpretación y simplifican la técnica de PCR, disminuyendo los inconvenientes de la técnica RAPD. Para obtenerlos es necesario purificar, clonar y secuenciar las bandas polimórficas detectadas y diseñar cebadores específicos. De este modo se obtuvieron las secuencias de los fragmentos: V03-1 (990 pb), V03-2 (1085 pb), A10-600 (563 pb) y A10-700 (711 pb). La secuencia V03-1 se seleccionó para diseñar cebadores que permitan amplificar en forma específica dicho fragmento polimórfico. Se analizaron en 25 muestras de ADN de diferentes individuos. Se compararon los perfiles de amplificación obtenidos con el cebador RAPD V03 y el par de cebadores específicos para analizar la ausencia/presencia de V03-1 en las mismas muestras de ADN, encontrando la banda de amplificación en las mismas muestras por ambos métodos. De este modo se eliminaron los demás productos obtenidos a partir de RAPD observando valores similares de frecuencia genotípica (0,32 y 0,37) por ambos métodos. De igual forma se trabajó con las secuencias obtenidas a partir del cebador RAPD A10. Los resultados obtenidos confirman la obtención de marcadores SCAR, con los cuales podrá evaluarse de manera más rápida y precisa la diversidad genética de diferentes poblaciones de vicuñas, contribuyendo de esta forma al estudio genético de esta especie.