“Identificación de Marcadores Moleculares mediante RAPD en el Genoma de Vicuña”

LONGO, A.E.; ROLDÁN-OLARTE, M; VALDECANTOS, P.A; GARCÍA, D.C; MICELI, D. C

Tafi del Valle, Tucumán

Jornada; XXIV Jornadas Científicas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2007

Asociación de Biología de Tucumán

La vicuña, especie perteneciente a la Familia Camelidae, estuvo en peligro de extinción debido a la caza indiscriminada para la obtención de su fibra de apreciado valor, debido a su finura. A partir del año 1969 se crearon convenios internacionales con el objeto de proteger y conservar la especie, logrando recuperar diferentes poblaciones de vicuñas. No obstante, no se conoce aún el grado de variabilidad genética de esta especie en Argentina. El conocimiento de la misma permitiría aportar información que contribuya a establecer normas de manejo racionales tendientes a la conservación de la especie. El objetivo del presente trabajo es identificar nuevos marcadores genéticos en el genoma de vicuña que permitan analizar la variabilidad genética de una población de vicuñas provenientes del INTA Abra Pampa (Jujuy), criadas en semicautiverio. Se trabajó con la técnica de Amplificación al Azar de ADN polimórfico (RAPD), la cual presenta las ventajas de que no requiere información acerca de la secuencia de ADN, el protocolo es rápido y fácil de realizar y permite generar nuevos marcadores genéticos. La técnica RAPD se basa fundamentalmente en el uso de cebadores cortos (10 pb) de secuencia arbitraria y condiciones poco restrictivas en la etapa de unión de dichos cebadores al ADN, con temperaturas de hibridación de 35-37 °C. En la generación de patrones de amplificación que permitan caracterizar individuos mediante RAPD, se ensayaron dos estrategias: 1) RAPD utilizando un conjunto 10 cebadores de secuencia arbitraria de 10 pb (cebadores RAPD serie A, de Biodynamics); 2) RAPD con cebadores de 20 a 22 pb con un 60-70 % de CG en las 10 bases del extremo 3´; los mismos fueron diseñados para amplificar secuencias de los genes TGF-b1, TGF-b2, BMP 15 y uPAR de otras especies. El ADN utilizado en la segunda estrategia, se obtuvo a partir de los folículos pilosos de fibras de vicuñas mediante un protocolo basado en el uso de una solución de lisis, conteniendo tiocianato de guanidina y purificación con cloroformo. Se analizaron 27 muestras. La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1,5%, teñidos con bromuro de etidio. Se seleccionaron 12 productos de amplificación por poseer probables polimorfismos de secuencias, ya que solamente estaban presentes en ciertas muestras y ausentes en otras. Dichas bandas fueron aisladas del gel de agarosa y purificadas. Algunas de ellas fueron clonadas para su posterior secuenciación. Los cebadores RAPDs se emplearon para amplificar 4 muestras de ADN obtenidas de sangre y determinar cuáles de ellos permiten generar patrones polimórficos de bandas de amplificación. El cebador A10 generó bandas diferenciales en las muestras analizadas, de las que se purificaron 5 para su posterior secuenciación. Estos resultados permiten concluir que las dos variantes empleadas de la técnica RAPD generaron patrones polimórficos de bandas de amplificación. Las bandas seleccionadas son potenciales marcadores genéticos. El conocimiento de sus secuencias permitirá desarrollar marcadores SCARs (Sequence Characterized Amplified Region) diseñando cebadores específicos para analizar la presencia o ausencia de dichas bandas en un número mayor de muestras. Este trabajo fue financiado con subsidios de Investigación de la AGENCIA de Promoción Científica y Tecnológica y Banco Santander/ RIO- UNIVERSIA.