Sondas fluorogénicas con fluorescencia modulada por pc-FRET.

CARLA C. SPAGNUOLO; RUDOLPH J. VERMEIJ; MARÍA V. MAÑALICH ARANA; ELIZABETH JARES-ERIJMAN

Rosario

Simposio; XIV SINAQO; 2003

Sociedad Argentina de Investigaciones en Química Orgánica

Se describe la síntesis de nuevas sondas fluorogénicas derivadas de (5,6-carboxi- 4',5'-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-il) fluoresceína (FlAsH) y 4',5'-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-il)-Resorufina (ReAsH) unidas covalentemente por un espaciador a un aceptor fotocrómico de transferencia de energía (FRET) de la familia de los ditieniletenos. Estas sondas tienen alta afinidad por proteínas que contienen cuatro residuos de cisteína en las posiciones i, i + i, i + 4, i + 5 de la cadena. Las proteínas pueden expresarse en células recombinantes. La formación de un complejo entre la sonda administrada extracelularmente, que penetra por su permeabilidad a través de membranas, y el motivo de 4 cisteínas, promueve la aparición de una señal fluorescente. La alta sensibilidad del fluoróforo en este entorno, permite el monitoreo de los cambios conformacionales de las proteínas en células vivas a través de cambios en la intensidad de fluorescencia. La modulación de la fluorescencia por pc-FRET permite la sustracción del ruido originado por la autofluorescencia. La radiación UV se utiliza para convertir al ditienileteno a su forma cerrada donde opera como aceptor de FRET de manera que se produzca el apagamiento de la emisión de la sonda fluorogénica. En la figura se presenta la secuencia sintética de una de las sondas fluorogénicas (FlasH) y una estructura modelo para transferencia de energía intramolecular. Se realizó un estudio de transferencia de energía intermolecular entre el FlAsH y el ditienileteno, en el cual se observó: i) el incremento en la fluorescencia de la sonda correlacionado con el aumento de la concentración por titulación con el péptido CCPGCC, demostrando el carácter fluorogénico del compuesto sintetizado; ii) el apagado de la fluorescencia de la sonda por titulación de la misma con ditienileteno en su forma cerrada aceptora, indicando la aparición del proceso de FRET, y iii) la desactivación y la activación reversible de este proceso controlado por fotoconversión del ditienileteno por irradiación con luz VIS (520 nm) y luz UV (340 nm), respectivamente.