Activación de la proteína Spleen Tyrosine Kinase (SYK) durante la fecundación en Bufo arenarum

MOUGUELAR, VALERIA S.; COUX, GABRIELA

Rosario

Congreso; Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Fisiologia; 2012

La fecundación consta de varios pasos secuenciales que se encuentran altamente conservados entre diversas especies. Uno de los últimos pasos es la activación del embrión. Se ha descripto que en la regulación de esta etapa participan múltiples proteína-tirosin-kinasas (PTK). De hecho, una gran variedad de procesos biológicos: división celular, diferenciación, etc., se encuentran regulados mediante la fosforilación/ desfosforilación de proteínas. Sin embargo, hasta el momento, es poco lo que se sabe acerca de la cascada de fosforilaciones y desfosforilaciones que se inicia luego de la interacción ovocito-espermatozoide y que conduce a la activación del embrión. Recientemente en nuestro laboratorio hemos descripto la participación de una proteína citosólica del ovocito con un peso aparente de 70 kDa que se fosforila en restos tirosina durante la fecundación. Nuestros objetivos en este trabajo fueron: i) estudiar el rol de esta proteína y su estado de fosforilación durante la fecundación en B. arenarum y ii) avanzar en su identificación. Mediante experimentos de fecundación in vitro en presencia de un inhibidor específico de tirosina quinasas (genisteína) seguidos de western-blot, se observó que la proteína de 70 kDa no se fosforila. Este resultado sugiere que el cambio de fosforilación observado depende de la acción de al menos una PTK. También se evaluó el efecto del ionóforo de calcio A23187. Bajo estas condiciones, la banda tampoco pudo observarse, lo que indicaría que la fosforilación de dicha proteína sería independiente del aumento de calcio intracelular que se produce luego de la fecundación. Las proteínas de la familia Spleen tyrosine kinase (SYK) y ZAP-70 presentan masas moleculares de 70 kDa aproximadamente, se activan por fosforilación de ciertos restos tirosina y han sido descriptas en cascadas de señalización fundamentalmente en células del sistema hematopoyético. Mediante PCR se analizó la presencia de mensajeros que codifican para las proteínas SYK y ZAP-70 en ovocitos depuestos de B. arenarum. Se obtuvo señal sólo para SYK. A fin de confirmar estos resultados se utilizaron dos anticuerpos monoclonales comerciales (C87C1 y 65E4, Cell Signaling) los cuales permiten analizar el grado de fosforilación de SYK en los residuos Y525/526 y Y352, respectivamente. Con ambos anticuerpos pudo observarse un aumento en el nivel de fosforilación de SYK debido a la fecundación. La fosforilación de las tirosinas 525/526 de SYK es esencial para la total activación de la actividad quinasa de SYK. La tirosina 352, por su parte, influye en la unión de SYK a proteínas como PLCg1, Vav1, PI3K, Lck y Grb2. Los resultados observados indican que: 1- SYK se expresa en ovocitos, siendo este el primer informe al respecto en vertebrados y, 2- durante la fecundación la proteína SYK estaría sufriendo un proceso de activación.