ESTUDIO DEL EFECTO DE FCCP SOBRE LA INTERACCIÓN DE ANS CON LIPOSOMAS DE DOPC (1,2-dioleil-sn-glicerol-3-fosfocolina) y DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolina)

ANDREA C. CUTRÓ; OSCAR A. ROVERI

Rosario, Santa Fe

Jornada; V Jornada de ciencia y Tecnología; 2011

Secretaría de Ciencia y Técnica

El carbonilcianuro de p-trifluorometoxifenil hidrazona (FCCP) es un desacoplante protonofórico [1], el que a altas concentraciones ejerce efectos adicionales sobre el metabolismo energético mitocondrial [2]. Previamente hemos mostrado que la unión de 1-anilin-8-naftalensulfonato (ANS) a liposomas es también afectada por FCCP. Por lo tanto, se decidió estudiar el efecto de FCCP sobre la unión de ANS a liposomas de 1,2-dioleil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC) a diferentes temperaturas (mesofase lamelar líquido-cristalina) y a liposomas de 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DPPC) a 25ºC (fase gel) y 50ºC (fase líquido cristalina). Se realizaron medidas de fluorescencia (λexc= 380 nm, λem= 480 nm). Las suspensiones de liposomas fueron obtenidas por el método de extrusión [3]. La concentración de lípidos fue determinada mediante el método colorimétrico para la cuantificación de Pi [4]. Tanto en fase gel (25º C) como en fase liquido-cristalina (50º C) FCCP inhibe completamente el incremento de la fluorescencia que se observa cuando ANS se une a liposomas de DPPC. Dicho efecto inhibitorio mostró tener un comportamiento hiperbólico con respecto a las concentraciones de FCCP ensayadas, siendo el valor de IC50 mayor para la fase líquido-cristalina (18.7 ± 4.7 µM) que para la fase gel (8.0 ± 1.8 µM). En ambos estados de fase, FCCP aumentó la Kd(ANS) aparente. Asimismo, se detectó una disminución del 40 % en la intensidad de fluorescencia máxima a las dos temperaturas ensayadas. FCCP también inhibió el aumento de fluorescencia asociado a la unión de ANS a liposomas de DOPC, aumentando el Kd(ANS) y disminuyendo la fluorescencia máxima. Los liposomas de DOPC están en fase líquido-cristalina a todas las temperaturas ensayadas. La unión de FCCP a la bicapa, fue exotérmica (H = - 6.1 ± 0.9 kcal mol-1, estimado a partir de la dependencia de los valores de IC50 (FCCP) con la temperatura). Por otra parte los parámetros termodinámicos para la unión de ANS fueron: H = - 3.1 ± 0.8 kcal mol-1 y S = 11.4 ± 2.7 cal K-1 mol-1 en ausencia de FCCP. En cambio en presencia de FCCP se pudo estimar un H = - 5.5 ± 1.3 kcal mol-1, mientras que el S estimado no fue significativamente distinto a cero. Los resultados presentados sugieren que FCCP es capaz de unirse a las membranas fosfolipídicas tanto en estado gel como en estado líquido-cristalino. En este último caso, la unión es entálpicamente conducida En cambio, los cambios de entalpía y de entropía contribuyen de manera similar en la unión de ANS a la bicapa. En presencia de FCCP la fuerza de las interacciones entre el ANS y la bicapa aumenta levemente (H más negativo). Sin embargo, este efecto es más que compensado por la marcada disminución del S de unión de ANS estimada. Este resultado permite sugerir que FCCP distorsionaría el arreglo de fosfolípidos en la bicapa, con la consiguiente disminución de la afinidad aparente de la misma por ANS.