Modelado por homología de los dominios de unión a almidón de las almidón sintasas III de Ostreococcus tauri.

JULIETA BARCHIESI; DIEGO GOMEZ-CASATI; MA. VICTORIA BUSI

Casilda

Congreso; XIV CONGRESO y XXXII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2012

Sociedad de Biología de Rosario

El almidón es la principal forma de almacenamiento y fuente de carbono y energía en organismos fotosintéticos. La almidón sintasa, una de las enzimas involucradas en su síntesis, cataliza la transferencia de un residuo de glucosa desde el ADP-glucosa al extremo no reductor de un glucano α-1,4 preexistente. En plantas superiores existen cinco familias diferentes de SS (por starch synthase): una unida a gránulo (GBSS, Granule Bound Starch Synthase), y cuatro formas solubles SSI, SSII, SSIII y SSIV/V. Cada isoforma ha adquirido un papel determinado en el metabolismo del almidón y estaría involucrada en la síntesis de las diferentes fracciones del polisacárido. Todas las SS presentan alta homología de secuencia en su extremo catalítico C-terminal. Sin embargo, difieren significativamente en su dominio N-terminal, pudiendo postularse que tales diferencias están relacionadas a las funciones específicas atribuidas a cada isoforma. En particular, la SSIII de A. thaliana (AtSSIII) contiene un dominio N-terminal específico que contiene tres repeticiones internas, y el dominio C-terminal responsable de la actividad catalítica. Cada una de estas repeticiones del N-terminal, denominadas D1, D2 y D3 codifica para un dominio de unión a almidón (SBD por Starch Binding Domain) los cuales desempeñan un papel crítico, principalmente el dominio D23, en la capacidad de unión al polisacárido y en la regulación y catálisis de la de la actividad de la AtSSIII. Asimismo, la interacción del dominio catalítico con los residuos 316-344 and 495-535 pertenecientes a los dominios D2 y D3, respectivamente, están involucrados en la modulación de la actividad catalítica de AtSSIII. Esta fue la primera caracterización de un SBD proveniente de una enzima biosintética de plantas, ya que originalmente fueron descriptos en enzimas degradativas de polisacáridos de origen microbiano, demostrándose además que se encuentra conservado en proteínas homólogas relacionadas en otras plantas y en algas verdes. El alga verde unicelular O. tauri pertenece al grupo de las Prasinophyceae, uno de los más antiguos dentro del linaje que dio lugar a las plantas verdes que actualmente dominan la fotosíntesis terrestre. Poseen una organización celular extremadamente simple, un único cloroplasto y mitocondria, un genoma muy compacto y es fácil de cultivar, lo que la hace un organismo modelo excelente. Además acumula almidón en un único gránulo dentro del cloroplasto. A pesar de dicha simplicidad genómica, O. tauri presenta una complejidad estructural respecto al metabolismo de polisacáridos comparable a la de plantas superiores. Sus rutas de síntesis y degradación del almidón contienen todos los pasos característicos de las plantas, con múltiples isoformas enzimáticas, convirtiéndolas en un modelo atractivo para investigar las propiedades generales de la biosíntesis del polisacárido. En particular, O. tauri presenta tres isoformas de la enzima almidón sintasa III, OtSSIII-A, OtSSIII-B y OtSSIII-C. Cabe destacar que estas enzimas difieren en el número de dominios de unión a almidón en su región N-terminal; OtSSIII-A presenta dos (OtAD1 y OtAD2), OtSSIII-B tres (OtBD1, OtBD2 y OtBD3) y OtSSIII-C carece de tales dominios. Con la finalidad de profundizar la caracterización de la función los SDB para cada una de las distintas isoformas de las almidón sintasas III de O. tauri se realizó un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de los mismos con los de A. thaliana utilizando el programa CLUSTAL-W. Dicho alineamiento mostró un alto grado de conservación de los dominios y de los residuos implicados en la unión a almidón; a excepción de OtBD1, que parece haber sufrido una deleción en su región N-terminal. Este resultado sugiere una conservación funcional de los SBD OtAD1, OtAD2, OtBD2 y OtBD3 de las SSIII de ambos organismos. Por otro lado, para iniciar la caracterización de la arquitectura de estos dominios, se construyeron modelos estructurales de OtAD1, OtAD2, OtBD2 y OtBD3 mediante el programa Modeller-TITO. Se utilizó como templado la estructura 3D del dominio de unión a glucógeno de la subunidad beta de la AMP proteína quinasa de Rattus norvegicus (PBD 1Z0N). Dicho dominio ha sido clasificado como miembro de la familia de CBM número 48 (del inglés Carbohydrate Binding Module), y presenta una homología de secuencia de 24-26% con los SBD de O. tauri caracterizados. Además, los modelos se confirmaron utilizando los programas Verify3D y ProsaII. La comparación entre el modelo y la estructura cristalina utilizada como templado reveló que la topología global es casi idéntica, consistente en varias láminas beta que forman un barril beta distorsionado. Dichos modelos concuerdan con el previamente reportado para el sitio de unión a almidón D2 de A. thaliana, perteneciente a la famila CBM53. Nuestro trabajo aporta evidencia de la preservación de la estructura cuaternaria y los residuos de unión a almidón en los SBD de O. tauri, sugiriendo un papel importante de los mismos en el metabolismo del almidón de este picoalga.