Efecto de la inoculación con Azospirillum a plantas mutantes de Arabidopsis deficientes en la producción de ABA sometidas a estrés hídrico

COHEN A,; PONTIN M.; BOTTINI R

Recife, Pernambuco, BRASIL

Congreso; XII Congreso Latinoamericano de Fisiología Vegetal, X Congreso Brasilero de Fisiología Vegetal; 2005

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal, Sociedad Brasilera de Fisiología Vegetal,

Efecto de la inoculación con Azospirillum a plantas mutantes de Arabidopsis deficientes en la producción de ABA sometidas a estrés hídrico Cohen Ana1, Pontin Mariela2 & Bottini Rubén2 1 Laboratorio de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, 5800 Río Cuarto, Argentina; 2 Cátedra de Química Orgánica y Biológica, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo, 5505 Chacras de Coria, Argentina. Email: acohen@unrc.exa.edu.ar, Phone: +54-358-4676103, Fax: +54-358-4676230 Introducción: Se utiliza comúnmente el término PGPR, (rhizobacterias promotoras del crecimiento en plantas), para agrupar a numerosos microorganismos del suelo que colonizan las raíces y estimulan el crecimiento vegetal (Kloepper y Schroth 1978). Estas bacterias se han inoculado a los cultivos con el objetivo de aumentar las cosechas. El género Azospirillum se ha estudiado extensamente entre las PGPR de vida libre (revisado por Kloepper, 2003).  Se han aislado principalmente de la rizósfera de cultivos de importancia económica como maíz, trigo y arroz (Patriquin et al. 1983). El efecto más característico en las plantas inoculadas con Azospirillum es un mayor desarrollo del sistema radical (Bashan y Holguin 1997;  Bertrand et al. 2000;  Fulchieri et al. 1993), lo que le confiere a la planta una mejor capacidad para incorporar nutrientes y agua (Okon 1994;  Sarig et al. 1988). Para explicar el aumento en el crecimiento y el rendimiento con la inoculación de Azospirillum, se tiene en cuenta la "hipótesis aditiva" sugerida por Bashan y Levanony (1990). Se ha asumido que estas respuestas pueden ser explicadas, al menos en parte, por la producción de fitohormonas producidas por las bacterias (Bloemberg y Lugtenberg 2001;  Bottini et al. 2004;  Persello-Cartieaux et al. 2003).  En efecto, especies de Azospirillum producen Giberelinas, (GAs) y la metabolizan en medio de cultivo y en asociación con la planta (revisado por Bottini et al. 2004). En este sentido, la aplicación de GAs (GA3) aumentó la densidad de los pelos radicales de forma similar a la inoculación con A. lipoferum (Fulchieri et al. 1993). También produce ácido indol acético (AIA) y otros compuestos indólicos como el ácido indol butírico que producen modificaciones en el sistema radical; y otras hormonas como citocininas (revisado por Bottini et al. 2004). Se ha observado que A.  lipoferum aumenta la producción de GAs en medios de cultivo con déficit hídrico impuesto por PEG (polietilenglicol) (Piccoli et al. 1999) y que aumenta la resistencia a estrés salino e hídrico (Creus et al. 1997;  Mayak et al. 2004). En resultados anteriores (Cohen et al. 2001), la inoculación de las plantas de maíz silvestre con A. lipoferum revirtió parcialmente el efecto de la inhibición de la síntesis de ácido abscísico (ABA) con fluridona.  Además, la inoculación con las bacterias mejoró el estado general de las plantas tratadas con este inhibidor (Cohen et al. 2004). El déficit hídrico es uno de los factores más importante que limita la productividad de las cosechas.  El estrés hídrico provoca modificaciones en la expresión génica. Durante la sequía, el aumento de los niveles endógenos de ABA reduce la pérdida de agua en la planta. Se han identificado mutantes de Arabidopsis thaliana deficientes en la síntesis de ABA. Los cuales germinan tempranamente, son susceptibles a marchites, presentan mayor conductancia estomática y habilidad para germinar y crecer en medios que contienen altas concentraciones de sacarosa y sal. Entre ellos, el mutante aao3 es deficiente en la síntesis de la enzima aldehído oxidasa, que cataliza el último paso de la biosíntesis de ABA. Por otra parte, el mutante aba-2-1 (Schwartz et al. 1997), posee una reducida habilidad para convertir xantoxina a aldehído abscísico en extractos crudos. La hipótesis de trabajo fue que Azospirillum sp. alivia el estrés hídrico impuesto por PEG en plantas mutantes de Arabidopsis deficientes en la la biosíntesis de ABA. Los objetivos fueron: determinar la concentración de inóculo efectiva en promover el crecimiento en plantas silvestres, y b) evaluar la longitud del hipocótilo y de la raíz en los mutantes aba-2-1 y aao3 en condiciones normales y bajo estrés hídrico. Materiales y Métodos: Semillas de Arabidopsis thaliana silvestres (ecotipo columbia) y mutantes aba-2-1 y aoo3 (cedidas por ABRC: Arabidopsis Biological Resource Center), se desinfectaron y se sembraron en placas de Petri con buffer ClK y Cl2Ca 1mM y agar 10 g/L. Se incubaron por 48 h a 4 º C y posteriormente crecieron durante 72 h a 23 º C bajo fotoperíodo de 16 h de luz y 8 de oscuridad. Una vez trascurrido este período, las plántulas fueron tranferidas a placas con el mismo buffer (C) o buffer más PEG (polietilenglicol 6%) para simular el estrés hídrico (E) y se mantuvieron en las mismas condiciones de crecimiento. A las 24 h se realizó la inoculación con Azospirillum (I). Así, los tratamientos fueron: 1) C; 2) I; 3) C + E; 4) I + E. Las mediciones de longitud del hipocótilo y de la raíz se realizaron a las 72 h y 144 h luego de la inoculación. Preparación del inóculo: El preinóculo se preparó en medio selectivo NFb y se incubó hasta obtener una concentración de 108-109 UFC.ml-1. El cultivo se centrifugó a 6000 g y 4 º C por 20 min y se resuspendió en PBS (buffer fosfato salino). Para determinar la concentración efectiva de la bacteria en promover el crecimiento de las plántulas silvestres, se realizaron diferentes diluciones y se determinó a los 25 días las UFC (unidades formadoras de colonias) adecuadas para realizar la experiencia. Resultados y Discusión En la Figura 1 se muestra el crecimiento de plantas silvestres, controles e inoculadas con diferentes concentraciones de Azospirillum (104, 106, 108 UFC.ml-1). La concentración efectiva en promover el crecimiento en las plantas silvestres inoculadas tanto de la parte aérea como del sistema radical fue de 106 UFC.ml-1. Esta fue utilizada posteriormente en las experiencias de crecimiento con los mutantes de la biosíntesis de ABA. C             104                    106                 108 Fig. 1: Inoculación a plantas silvestres de Arabidopsis thaliana con PBS (C) y diferentes concentraciones de A. lipoferum (104, 106, 108 UFC.ml-1). En la experiencia realizada con los mutantes deficientes en la síntesis de ABA se comenzaron a observar  diferencias en la morfología de las raíces a las 48 h posteriores a la inoculación (I). En las plantas I se observó la presencia de pelos radicales en las zonas cercanas al ápice, característica que no se observó en las plantas controles (C). Recién a las 72 h luego de la inoculación, las plantas C mostraron desarrollo de pelos radicales, aunque la disposición fue diferente a la de las plantas I. En las primeras se presentaron distribuídos a lo largo de toda la raíz pero sólo sobre un lado de la misma; mientras que en las I se observaron regiones en donde se presentaban numerosos pelos radicales; siendo éstos de mayor longitud a los de las plántulas C. En las plantas bajo estrés hídrico, la presencia de pelos radicales se observaron a las 72 h sólo en las plántulas I. Resultados observados en los dos tipos de mutantes (datos no mostrados). Cuando se realizaron las mediciones de longitud del hipocótilo y de la raíz principal (72 h) sólo se encontraron diferencias significativas en el crecimiento del hipocótilo de plántulas mutantes aao3 I comparadas con los otros tratamientos (Fig. 2a); sin embargo a las 144 h, se observó una mayor longitud de la raíz principal en las plántulas mutantes aba-2-1 inoculadas sometidas a estrés (I +E) comparadas con las controles crecidas bajo las mismas condiciones (C + E). Al parecer sería necesario un mayor tiempo (> 72 h) para simular estrés hídrico y poder observar los efectos promotores de la bacteria sobre el crecimiento de raíz principal en estas condiciones. Cabe destacar que en estudios previos (Piccoli et al. 1999) se vió que la concentración bacteriana en cultivos con PEG disminuye significativamente, por lo que esto podría explicar la necesidad de un mayor tiempo para comenzar a observar un efecto promotor de la bacteria sobre el crecimiento de la raíz principal (Fig. 2b), así como también, un posible efecto promotor sobre el crecimiento del hipocótilo bajo condiciones de estrés.                                 a) Figura 2: Longitud del hipocótilo y de la raíz a las a) 72 h y b) 144h  para los tratamientos: C (control), C + E (control + estrés), I (inoculado), I + E (inoculado + estrés) Conclusión: Estos datos sugieren que Azospirilum podria aliviar el estres (impuesto por PEG) en plantas de Arabidopsis deficientes en la síntesis de ABA, al menos en parte, estimulando el crecimiento del sistema radical. Referencias Bibliográficas: Bashan, Y.; Holguin, G. 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