Reproducción experimental en ovinos de una cepa de Fasciola hepatica de origen bovino resistente al triclabendazole

OLAECHEA, F.; LARROZA, M; SOLANA H.; SCARCELLA S; CARNEVALE S; CABRERA, R.

Mercedes, Corrientes

Congreso; XVIII Reunion cientifica técnica Asociacion Argentina de veterinarios de laboratorios de diagnostico.; 2010

Introducción   La resistencia a fasciolicidas es emergente en todas las áreas endémicas del mundo desde hace dos décadas, en Argentina se reportó el primer evento de resistencia al Triclabendazole (TCBZ) (Olaechea y col, 2010) en bovinos de Neuquén. Siendo el TCBZ la droga conocida como la más efectiva para controlar la fasciolosis, se iniciaron trabajos experimentales tendientes a confirmar el hallazgo de campo. En el presente trabajo se describen las actividades de colección de metacercarias del establecimiento donde fracasó la dosificación con TCBZ, aún a doble dosis, la infección experimental en corderos y el seguimiento coprológico y serológico de la infección.   Materiales y Métodos   Obtención de metacercarias Se colectaron 1114 caracoles Limnaea viatrix de los potreros donde pastoreaban los bovinos que expresaron las fallas a los tratamientos con TCBZ. Estos fueron transportados al Laboratorio de la EEA Bariloche para diagnosticar bajo lupa estereoscópica si estaban infectados o no, luego se los mantuvo en estufa a 24 C, hasta considerar que se podían extraer las cercarias, estas fueron adheridas a papel celofán, fraccionadas en dosis de 200 metacercarias (mc) y guardadas en heladera hasta su uso. Animales de experimentación Se seleccionaron 16 corderos Merino, de 5 meses de edad, con un promedio de peso de 26,2 kg, libres de parásitos y se alojaron juntos en un potrero de un área libre de Fasciola, con pastoreo y agua a disposición. Se conformaron al azar 2 grupos, el grupo 1 (G1) de 10 corderos que  fueron infestados vía ruminal por sonda esofágica, con 200 mc cada uno y el grupo 2 (G2), de 6 corderos que se mantuvieron libres de infección por Fasciola. Toma de  muestras Se tomaron muestras individuales de sangre y de materia fecal de todos los ovinos al inicio del ensayo, previo a la infección del G1 (día 0) y a los 49, 63, 79, 94 y 109 días. Al finalizar el ensayo se necropsiaron los corderos y se recuperaron los hígados para conteo de parásitos. Análisis realizados Los sueros de las muestras de sangre extraídas sin anticoagulante de la vena yugular, fueron procesados con el test de ELISA para fasciolosis empleando el antígeno recombinante rproCL1 (Carnevale y col, 2001). Además se cuantificaron proteínas séricas totales y ciertas enzimas marcadoras de daño hepático (GLDH , γGT, GOT y GPT). Las muestras de materia fecal fueron procesadas con el método de sedimentación-filtración haciendo conteos de huevos por gramo de materia fecal en las muestras positivas. A la necropsia se extrajo el hígado y 10 cm de duodeno. Los conductos biliares y la vesícula biliar se abrieron y fueron lavados con agua de la canilla para recolectar y contar las Fasciolas visibles a simple vista. Luego el hígado se cortó en láminas de 1 cm, y se extrajeron del parénquima, trematodes enteros o partes. Las láminas cortadas se comprimieron manualmente y se las coloco en agua a temperatura ambiente, donde se las volvió a comprimir para facilitar la salida de los trematodes que luego se recolectaron de la solución, previa extracción de las láminas de parénquima hepático.   Resultados   De los 1114 caracoles colectados en cuatro oportunidades entre diciembre de 2009 y marzo de 2010, se examinaron 909 de los que 39 estaban con presencia de Fasciola en distintos estadíos. El 99% de los caracoles infectados fue colectado en enero del 2010, de ellos se colectaron 2000 mc (promedio 51 mc por caracol), que fueron acondicionadas en inóculos de 200 mc. El 100% de los corderos del G1 fueron detectados por el test de ELISA, como infestados por Fasciola hepatica en las muestras extraídas el día 49 pos infestación, momento en que se expresaron los mayores valores de densidad óptica. Mientras que la coprología reveló recién en el día 63, el 78 % de positivos, para llegar al 100% a los 94 días de haber sido infestados. Los promedios de huevos de Fasciola por gramo de materia fecal en el G1 se iniciaron en el día 63 con un valor de 9,2 (rango 0 - 33), para llegar al día 94 a un máximo de 52,4 (rango 7 - 115). Las proteínas séricas totales del grupo G1 tienden a disminuir en función del tiempo post-infección. Cuando se analizaron las enzimas GLDH , γGT, GOT y GPT no se detectaron grandes variaciones con respecto al grupo G2, probablemente debido a que la carga parasitaria no es lo suficientemente importante como para provocar serio daño hepático. A la necropsia del G1, hubo un promedio de 28,9 Fasciolas recuperadas (14,5 % de las metacercarias inoculadas). Los parásitos eran adultos y midieron entre 1,3 a 2,4 cm, siendo el promedio de 1,9 cm. Por otro lado, los corderos del G2, control, fue negativo a todos los análisis realizados y a la necropsia tenían el hígado sano, sin presencia de F. hepatica. Al análisis de sus proteínas séricas y enzimas hepáticas, dichos parámetros se mantuvieron siempre dentro de los valores normales.      Discusión  Hasta el presente, en el continente americano no se tenía registrada la presencia de resistencia de F. hepatica a fasciolicidas. Cuando se reporta la sospecha y se repiten los resultados con el trabajo a campo, es necesario diseñar un ensayo con la mayor cantidad de variables controladas como para confirmar que se ha encontrado una cepa resistente. En trabajos previos se utilizan huevos de Fasciolas sospechosas y se realiza el trabajo de reproducción en laboratorio. En nuestro trabajo se tomaron caracoles infectados del ambiente, de donde se extrajeron las metacercarias, que luego fueron utilizadas para inocular corderos que se mantuvieron a campo en un potrero libre de Fasciola. De esta manera, se iniciaron rápidamente los ensayos de confirmación y se evitó la cría de caracoles que suele ser lenta y engorrosa, así como el mantenimiento de animales a corral que necesita mayores cuidados y atención. Si bien los porcentajes de infestación pueden considerarse relativamente bajos (14,4%), la cantidad de parásitos logrados por cordero y por grupo, fue suficiente como para confirmar el hallazgo de resistencia al triclabendazole (Olaechea y col. Datos no publicados). Se destaca la precocidad del diagnostico por ELISA, que luego es confirmado a partir de la presencia de huevos detectada en los análisis coprológicos