Mecanismos involucrados en la resistencia y degradación del tetradeciltrimetilamonio por Pseudomonas putida.

BOERIS, PS; LIFFOURRENA, AS; LUCCHESI, GI

Buenos Aires

Congreso; Congreso Internacional Biotecnología. BairesBiotec; 2005

Introducción Las sales sintéticas de amonio cuaternario (QACs), entre las que se encuentran ciertos detergentes como el tetradeciltrimetil-  amonio (TDTMA), son compuestos biogénicos de amplio uso en la industria, formando parte de agentes antiespumantes, surfactantes, bactericidas, antiestáticos y cosméticos. En general son removidas del ambiente por adsorción y degradación en plantas de tratamiento de aguas, si bien concentraciones reducidas entran al ambiente y no son degradas completamente, dando lugar a la formación de compuestos recalcitrantes. En nuestro laboratorio demostramos que un cultivo puro de P. putida A ATCC 12633 es capaz crecer en presencia de altas concentraciones de TDTMA (50 mg l-1). El paso inicial en el metabolismo de este QAC involucró la ruptura de la unión C-N, generando tetradecanal y trimetilamina, catalizado por una actividad monooxygenasa, la que fue parcialmente caracterizada. La capacidad de P. putida A ATCC 12633 de crecer en presencia de 50 mg l-1 de TDTMA como única fuente de C y N mostró, en contraste con estudios previos, la habilidad de un cultivo puro para metabolizar altas concentraciones de un surfactante catiónico. En este trabajo se evaluaron las condiciones de crecimiento y los cambios a nivel de fosfolípidos como mecanismo adaptativo que le permitiría a P. putida crecer en presencia de concentraciones elevadas de TDTMA.   Metodología -Microorganismos y condiciones de cultivo: P. putida A ATCC 12633 se hizo crecer en medio mínimo salino conteniendo 10 a 150 mg l-1 de TDTMA como única fuente de carbono y nitrógeno. Se determinó la mínima concentración inhibitoria del crecimiento (MIC). Cultivos de P. putida crecidos durante 48hs con 50 mg l-1 de TDTMA se dividieron y el crecimiento se continuó en presencia o ausencia de 0.1 mM de AlCl3. -Determinación de TDTMA y trimetilamina (TMA): TDTMA se determinó por método colorimétrico basado en la formación del complejo TDTMA-azul de bromotimol, el cual se extrae con HCCl3 y se lee a 420 nm. TMA se siguió por GC-MS. Se utilizó una HP-columna (Crosslinked Methyl Silicone Gun, 25m x 0,32 mm x 0,17 μm film thickness). La velocidad de flujo del gas helio fue 30 ml min-1. La temperatura del detector, inyector y columna fueron 280 ºC,  250 ºC y 50 ºC, respectivamente, y el volumen de inyección fue de 1 μl. -Extracción e identificación de fosfolípidos: Se realizó según (Bligh y Dyer 1959). Los fosfolípidos se resolvieron por TLC, se revelaron por tinción con vapores de yodo y tinciones específicas (Kates, 1986). -Cuantificación de fosfolípidos: Se realizó según (Fiske y SubbaRow 1925). Resultados y Discusión Dado que las concentraciones residuales encontradas en el ambiente de QACs (5-20 mg l-1) son muy inferiores a la CIM de TDTMA para P. putida (150 mg l-1),  estas concentraciones no serían impedimento para el  crecimiento de esta cepa y posterior degradación de detergentes catiónicos presentes en el ecosistema. -Crecimiento de P. putida y consumo de TDTMA. La correlación entre el crecimiento bacteriano y el consumo de detergente cuando P. putida se hizo crecer en presencia de TDTMA como única fuente de C y N (Fig. 1), muestra que el crecimiento ocurre coincidentemente con la desaparición del detergente. La escasa masa celular obtenida en el proceso de biodegradación (0,26 mg proteínas mg TDTMA-1) se atribuyó a la limitación de nitrógeno aportado por el detergente sumado al efecto inhibitorio del crecimiento dado por la acumulación de TMA, producto formado en el primer paso de degradación del compuesto. La Fig 2 muestra que la adición de 0.1 mM de AlCl3 contribuye a disminuir la concentración intracelular de TMA a través de la reacción: AlCl3 + :N(CH3)3 ® Cl3Al:N(CH3)3. La consecuencia de esto es el  incremento del crecimiento bacteriano y nuevo consumo de TDTMA. Figura 1.- Crecimiento (▪) y consumo de TDTMA (•) de P. putida en HPi-BSM con: TDTMA 50 mg l-1 como única fuente de carbono y nitrógeno. Figura 2.- Crecimiento de P. putida (▲, ■) y consumo de TDTMA (∆, □). En el punto indicado por la flecha, el cultivo fue dividido y el crecimiento continuó en presencia (▲, ∆) y ausencia (■, □) de 0.1 mM AlCl3 -Relación entre resistencia a TDTMA y la composición de fosfolípidos de P. putida. Los cambios a nivel de fosfolípidos totales y específicos luego de exponer células de P. putida crecidas con glucosa y NH4Cl a TDTMA 50 mg l-1 durante 15 y 30 minutos se muestran en Fig. 3 A y B. Los PL totales de P. putida aumentaron significativamente (143%) cuando el microorganismo se enfrentó durante 15 min a TDTMA, valores que se restauraron a niveles semejantes al control, 30 min post-exposición. A los 15 min post-exposición al detergente, PE disminuye mientras que LPE aumenta. Tanto a los 15 min como a los 30 min post-exposición a TDTMA, CL disminuye mientras que PG y PA aumentan significativamente. Figura 3.- Cuantificación de PL totales (A) y específicos (B) de P. putida. Los datos representan la media n= 3 ±  SE, *p < 0,05. Conclusiones: La adición de AlCl3 al medio facilita la degradación de TDTMA. El aumento en el total de PL y las variaciones en el contenido de PL específicos de P. putida A ATCC 12633 enfrentada diferentes tiempos a TDTMA, sugiere un mecanismo adaptativo de reparación de membranas para contrarrestar el efecto del surfactante. Esto, asociado a la capacidad de crecer y tolerar altas concentraciones de TDTMA, muestra el potencial de P. putida A ATCC 12633 para ser utilizada como vehículo para la eliminación de estos contaminantes ambientales. Referencias bibliográficas: Bligh, EG y WJ, Dyer (1959) J. Biochem. Physiol. 37: 911-918 Fiske, CH y Y. SubbaRow (1925). Methods in Enzimology. Colowick, S.P. y N.O. Kaplan.Vol XIV. Pag. 486. Lipids. Dited by Lowenstein, J.M. Kates, H (1986) Separation of lipid mixture: Technique of lipidology. Work, T.S. y Work, E. eds. Pp241. North holind Publishimg Company, Amsterdam and London. P.H.