Determinación in vitro de la actividad antioxidante de compuestos fenólicos con actividad gabaérgica

DELGADO MARÍN LE, SÁNCHEZ-BORZONE M., GARCÍA DA.

Buenos Aires

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química y 4to. Workshop de Química Medicinal; 2010

Asociación Química Argentina

Introducción             El receptor GABAA posee diferentes lugares de reconocimiento para la unión de ligandos específicos como el GABA, principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central, y otros como benzodiazepinas, barbitúricos, neuroesteroides, etanol, anestésicos (propofol) y agentes convulsivantes del tipo de la picrotoxina [1]. Numerosos productos de origen natural han sido estudiados por nuestro grupo de trabajo como posibles moduladores del receptor GABAA [2,3]. Entre ellos, timol ha mostrado actividad sobre el receptor actuando como un modulador positivo a bajas concentraciones y como agonista de GABA a concentraciones mayores [4,5,6]. En un trabajo reciente se demostró también actividad gabaérgica de otros compuestos fenólicos de origen natural como carvacrol y eugenol [7]. Por otra parte, ha sido demostrado que muchos agentes anestésicos son capaces de reducir el daño provocado por isquemia en el cerebro actuando de diversas maneras, más allá del hecho de contribuir a la reducción de la actividad metabólica. Así, su actividad neuroprotectora radicaría entre otras cosas, en la suma de sus propiedades antioxidantes, la actividad  sobre el receptor GABAA y la inhibición de la liberación de glutamato [8-10]. En este contexto, el presente trabajo tiene como objetivo evaluar la actividad antioxidante de compuestos fenólicos con probada actividad sobre el receptor GABAA como un primer paso para determinar los eventuales mecanismos neuroprotectores mediados por este tipo de compuestos y definir la relación estructura-actividad de los mismos. Metodología Se incluyeron en el presente trabajo cinco compuestos fenólicos: eugenol, timol, propofol, carvacrol y clorotimol. Propofol es un compuesto de síntesis, clorotimol es un monoterpenoide derivado de timol y los demás son componentes importantes de numerosos aceites esenciales. Timol y carvacrol son extraídos de aceites esenciales de numerosas especies de tomillo (género Thymus) y de orégano (gen. Origanum) respectivamente, mientras eugenol se encuentra en numerosas especies como la albahaca y el clavo de olor (gen. Ocimum y Syzygium) [11,12]. Para determinar la actividad antioxidante de estos compuestos se utilizaron los siguientes ensayos espectrofotométricos: -          Actividad anti-radical por reducción de DPPH (según ref.[13], con modificaciones). Se utilizó DPPH como radical libre evaluándose diferentes concentraciones de cada compuesto (entre 7,5 y 250µM). Se evaluó la disminución de la absorbancia de DPPH (λ: 516nm) en función del tiempo frente a cada compuesto, y se tomaron las absorbancias cuando la reacción alcanzó un estado estable. Previamente fueron analizados tanto el espectro de absorción como la curva de calibración de DPPH en metanol. De esta manera, se calcularon los porcentajes de DPPH reducido  en función de la concentración relativa del compuesto para finalmente determinar la cantidad de antioxidante necesario para disminuir el 50% del DPPH inicial (EC50) y así calcular su poder anti-radical (ARP= 1/EC50). -          Reducción de peróxido de Hidrógeno (H2O2) Se utilizó una solución de H2O2 4mM preparada en PBS (pH 7,4) a la que se agregaron los compuestos a testear a concentraciones finales de 200µM.  La disminución en la concentración de H2O2 fue monitoreada a 230nm a 10min de agregado cada compuesto, frente a un blanco con el compuesto en PBS sin H2O2. Ver detalles en ref. [14]. -          Ensayo FRAP Este ensayo determina el poder antioxidante mediante la capacidad de reducción del ión férrico a ferroso según el método descripto por Benzie y Strain [15]. Brevemente, se determina a bajo pH la reducción del complejo Fe3+-TPTZ (tripiridil-triazina) a Fe2+ mediante el incremento de la absorbancia a 593nm. Resultados             El análisis de los resultados de los ensayos de DPPH mostró que todos los compuestos ensayados poseen una cinética de reacción lenta comparado a otros antioxidantes [13] lo cual indica una reacción progresiva a lo largo del tiempo entre los compuestos antioxidantes y el DPPH. Los valores de ARP determinados indican un potencial anti-radical comparativamente mayor para eugenol, intermedio para clorotimol y propofol y menor para carvacrol y timol. Por su parte, el valor obtenido para eugenol es comparable al poder antioxidante del ácido ascórbico utilizado como referencia.             En cuanto a su capacidad para la reducción de H2O2, eugenol también reveló una mayor actividad con valores 5 veces mayores a los determinados para carvacrol y timol, manteniéndose propofol y clorotimol con valores intermedios y demostrando este último una actividad algo mayor que propofol.             Los experimentos de FRAP confirmaron en general los datos obtenidos con los otros dos ensayos, indicando un poder antioxidante para los compuestos ensayados en el siguiente orden descendente: eugenol, propofol, clorotimol, carvacrol y timol. Conclusiones Los datos obtenidos de los ensayos realizados in vitro para comprobar la actividad antioxidante de los compuestos muestran un orden de potencia entre ellos que no se correlaciona con su potencia farmacológica sobre el receptor GABAA (orden creciente de actividad: clorotimol, eugenol, carvacrol, timol y propofol). Este resultado implicaría que su eventual capacidad neuroprotectora (a evaluarse próximamente en nuestro grupo) podría ser una suma de ambos efectos con un propio orden de potencia, lo que nos aportaría importantes datos sobre los principales mecanismos implicados en la protección a nivel neuronal ante la privación de oxígeno y/o nutrientes.   Referencias 1.Mac Donald and Olsen (1994) Biochem Pharmacol. 68:1675 2.García et al. (1995) Lipids. 30:1105 3.Perillo et al. (1999) Mol Membr Biol. 16:189 4.Sánchez et al. (2004) Coll Surf B. 34:77  5.García et al. (2006) Neuropharmacol. 50:25 6.García et al. (2008) Eur J Pharm. 600:26 7.      Reiner et al. (2007) XXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Neurociencias. 8.Kawaguchi et al. (2005) J Anesth. 19:150. 9.Grasshoff et al. (2005) Curr Opin Anaesthesiol. 18:386. 10.   Asahi et al. (2006) Anesth Analg. 102:772. 11.   Hazzit et al. (2006) J Agric Food Chem. 54:6314. 12.   Santoro et al. (2007) Exp Parasitol. 116:283 13.   Brand-Williams et al. (1995) Food Sci Technol. 28:25. 14.   Ruch et al. (1989) Carcinogenesis. 10:1003. 15.   Benzie and Strain (1996) Anal Biochem. 239:70. Este trabajo fue financiado por SECyT-UNC, FONCyT y MINCyT-Córdoba.